薄層色譜分離技術(shù)

關(guān)于薄層色譜分離技術(shù)第一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第一節(jié)薄層色譜概論薄層色譜(Thin-LayerChromatographyTLC)是快速分離、定性和定量分析的一種非常重要的色譜技術(shù)。它是將固定相涂布于玻璃，鋁鉑，塑料片等載板上形成一均一薄層。將被分離的物質(zhì)點(diǎn)加在薄層的一端，置展開室中，選用適當(dāng)?shù)恼归_劑，借毛細(xì)作用從薄層點(diǎn)樣的一端展開到另一端，使性質(zhì)不同的物質(zhì)得以分離。第二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三一、TLC的分離原理分離原理隨所用固定相不同而不同，可分為:(l)吸附薄層色譜采用硅膠、氧化鋁等吸附劑鋪成薄層，利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附能力的差別達(dá)到分離的目的。(2)分配薄層色譜由硅膠、聚酰胺和纖維素鋪成薄層，不同組分在指定的兩相中有不同的分配系數(shù)。(3)離子交換薄層色譜由含有交換活性基團(tuán)的纖維素鋪成薄層。(4)分子排阻薄層色譜也稱凝膠薄層。利用樣品中分子大小不同、受阻情況不同加以分離。(5)親和薄層色譜利用酶、受體、抗原抗體特異性識(shí)別作用。第三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三二、TLC的技術(shù)參數(shù)1.比移值:一個(gè)化合物在薄層板上上升的高度與展開劑上升的高度的比值稱為該化合物的比移值（Rf

值）。是薄層色譜的基本定性參數(shù)。

第四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2．相對(duì)比移值(Ri，s)由于影響被分離物質(zhì)在薄層上移動(dòng)距離的因素較多，因此Rf值的重現(xiàn)性較差，如果將被分離物質(zhì)與一參比物點(diǎn)在同一塊薄層上，用相同的色譜條件進(jìn)行分離。相對(duì)比移值就是被分離物質(zhì)(s)和參比物(i)的Rf值之比，或是被分離物質(zhì)(s)和參比物（i)在薄層上移動(dòng)距離之比.由于參比物的Rf值或移動(dòng)距離可大于或小于被分離物質(zhì)的Rf值或移動(dòng)距離，因此相對(duì)比移值可大于或小于l，但其重復(fù)性及可比性均優(yōu)于Rf值。相對(duì)比移植以下式表示：Ri,s=Rf(i)/Rf(s)第五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三三、TLC的應(yīng)用特點(diǎn)：TLC不僅適合于小量樣品的制備，也可用于較大量樣品的純化。如果將薄層加寬加厚，把樣品點(diǎn)成一條線，能分離幾百毫克樣品。尤其是對(duì)于Rf值相近的物質(zhì)的分離。TLC除了用于分離外，更主要的是通過與已知結(jié)構(gòu)化合物相比較，來鑒定少量有機(jī)混合物的組成。此外,經(jīng)常利用TLC尋找柱色譜的最佳分離條件。常用的兩種制備型薄層色譜包括：傳統(tǒng)的制備薄層法（PTLC），即流動(dòng)相借毛細(xì)作用流經(jīng)固定相。借外力強(qiáng)制性的使流動(dòng)相流經(jīng)固定相，如離心薄層和加壓薄層。第七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第二節(jié)制備薄層色譜

(PreparativeThinLayerChromatographyPTLC)

一、固定相及載體二，粘合劑與添加劑三、薄層板的制備四，上樣五、展開劑選擇六、薄層展開七、檢測方法八、被分離物質(zhì)的收集九、PTLC分離化合物的純化第八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

經(jīng)典的制備型薄層色譜，設(shè)備簡單，操作方便。薄層色譜與常壓柱分離配合使用，仍然在實(shí)驗(yàn)室中有較多的應(yīng)用。尤其是在一些沒有現(xiàn)代分離手段的實(shí)驗(yàn)室中廣為使用。第九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三一、固定相及載體1．固定相：薄層色譜必須將被分離物質(zhì)點(diǎn)于固定相上進(jìn)行分離，固定相要根據(jù)被分離化合物的性質(zhì)來選擇。分離親脂性化合物常常選用硅膠，氧化鋁，乙酰纖維素及聚酰胺。分離親水性化合物常常選用纖維素，硅藻土及聚酰胺。但也有例外，脂溶性葉綠素在氧化鋁及纖維素上均能得到較好的分離。2．載體：玻璃板，鋁箔，塑料片等（吸附薄層）；纖維素，硅藻土（分配薄層）第十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三（1）．硅膠：是最常用的薄層固定相，90％以上分離工作都應(yīng)用之。１）普通型硅膠：無定型多孔粉末，表面帶有硅醇基，呈弱酸性。因?yàn)橛幸涣u基(silanolSi-OH)，呈弱酸性（PH=4.5）,通過硅原子上的羥基與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵，所以表現(xiàn)為吸附性能。硅膠吸附水分形成水合硅醇基，降低吸附能力。通常在150℃活化后失水提高活度，此時(shí)約有4－6個(gè)硅醇基/nm2,。（溫度大于500℃，硅膠脫水形成硅醚（Si－O-Si）,而失去吸附能力）。—活性硅膠適合分離酸性或中性化合物，如酚類，醛類，生物堿類，甾體及氨基酸類，是基于吸附作用；—非活性硅膠含有一定量的水分，在分離色素等時(shí)，是基于分配作用。第十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

２）改性硅膠：借化學(xué)反應(yīng)，將有機(jī)分子鍵合在硅羥基上，故稱化學(xué)鍵合固定相?？煞譃闃O性鍵合相和非極性鍵合相。①極性鍵合硅膠：含極性基團(tuán)（如氰基，氨基，二醇基），與普通硅膠相比活性低。一般作正相色譜，用非極性或極性溶劑為展開劑②非極性鍵合硅膠：鍵合相表面為極性極小的烴基如18烷基，乙基，辛基等。最常用的是18烷基鍵合硅膠。用極性較大溶劑為展開劑或無機(jī)溶劑為展開劑。因?yàn)镽f與正相色譜相反，故稱反相薄層色譜法。第十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三3)硅膠的粒度與孔徑：硅膠的分離效率與其粒度、孔徑及表面積等幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)。原則上，粒度越小，分離效果越好。孔徑（?）或孔體積表示硅膠粒子孔的大小的尺度，與傳遞阻滯有關(guān)；表面積越大，表明其吸附力越大，有較強(qiáng)的保留。第十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

4）硅膠薄層板的厚度普通薄層厚度為250μm,高效薄層板為200μm，制備薄層板厚度0.5-2mm第十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三5）市售硅膠及預(yù)制板規(guī)格（符號(hào)及含義）

硅膠G:

是含有13％煅石膏（gypsum）黏合劑的硅膠

硅膠H：不含黏合劑的硅膠

硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無機(jī)熒光劑（如錳激活的硅酸鋅），在254nm波長紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光

硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長紫外光下呈強(qiáng)烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長有熒光硅膠PF254：制備型的，在254nm有熒光（有熒光劑，適用于不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與分離）第十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2．氧化鋁：在薄層中其應(yīng)用僅次于硅膠。由氫氧化鋁400－500℃煅燒而成。廣泛的用于萜類，生物堿，脂肪類，芳香類化合物的分離。因制法和處理方法不同可分為堿性，酸性，中性三類⑴堿性氧化鋁：PH9－10適于中性、堿性化合物的分離⑵酸性氧化鋁：PH4－5適于酸性化合物的分離⑶中性氧化鋁：PH7－7.5適于酸性或?qū)A不穩(wěn)定的化合物的分離氧化鋁因其含水量活性可分為五級(jí)。制備型薄層用氧化鋁選用2－3級(jí)第十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三市售氧化鋁：Ａ．含10％G，PH7.5－8；Ｂ．不帶粘合劑的氧化鋁PH=9,也可加入波長254nm的熒光指示劑。

第十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三3．纖維素

與紙層析相似，按分配的原理。纖維素分子是由大量纖維二糖通過糖苷鍵連接的，由于有許多的OH基，所以具有親水性。一分子水與與纖維素的兩個(gè)羥基結(jié)合，形成“纖維素－H2O”絡(luò)合物。這種固定相可以視為一種多糖濃溶液，即使使用與水相混溶的溶劑時(shí)，仍然形成類似不相混溶的兩相。第十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三層析用纖維素分：普通纖維素乙?；w維素離子交換纖維素第二十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三4．聚酰胺：聚酰胺是由酰胺聚合而成的高分子聚合物，薄層色譜中常用的是聚己內(nèi)酰胺。聚酰胺分子內(nèi)有許多酰胺基，酰胺基中的碳基與酚類、黃酮類、酸類中的羥基或羧基形成氫鍵；酰胺基中的氨基與酮類或硝基化合物形成氫鍵，同時(shí)由于所分離混合物結(jié)構(gòu)不同，含羥基等活性基團(tuán)的數(shù)目和位置不同，因而形成氫鍵的能力不同，所以對(duì)這些化合物的吸附能力不同而得到分離。第二十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

5．葡聚糖凝膠

分子篩的原理(1)親水性葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷，dextran)懸浮于有機(jī)相中，加入交聯(lián)劑使葡聚糖交聯(lián)聚合而成．其商品名為Sephadex，加入交聯(lián)劑量不同可制成不同交聯(lián)度的凝膠．交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水時(shí)膨脹體積越?。糜诒由V的凝膠粒度要細(xì)，小于40um,交聯(lián)度要低，G－50以下．第二十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三(2)親酯性萄聚糖凝膠

萄聚糖凝膠只能用于水溶性物質(zhì)的分離鑒定。但在葡聚糖分子上引入有機(jī)基團(tuán)，則可使之成為親脂性葡聚糖凝膠，如在G—25凝膠上引入羥丙基基團(tuán)，與糖分子以醚鍵相連，使之成為既有親水性又有親脂性的LH—20葡聚糖凝膠，適用于有機(jī)物如黃酮、蒽醌、色素等成分的分離。第二十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三6.離子交換劑

葡聚糖凝膠離子交換劑

在G—25或G—50葡聚糖凝膠上引入羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙基及季銨乙基等而制成的既具凝膠的優(yōu)點(diǎn)又具離子交換性質(zhì)的載體，在生化及天然化合物方面得到廣泛應(yīng)用。第二十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三7．硅藻土

硅藻土商品名celite，是高度多孔的，比表面積大的固體，本身具極弱的吸附力，常作為分配色譜用的載體；或以一定比例加入硅膠等吸附劑中可以降低硅膠的吸附力，而有利于某些化合物的分離。第二十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三二，粘合劑與添加劑

為使薄層牢固地附著于支持體上需加合適的粘合劑;為特殊的分離檢出有時(shí)要在固定相中加入某些添加劑.

理想的粘合劑要求親水性好、粘結(jié)力強(qiáng)，且具有化學(xué)惰性第二十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三1，煅石膏

將石膏（CaSO4.2H2O）在120－140℃烤2－4小時(shí)，過200目篩，備用。用煅石膏作粘合劑的優(yōu)點(diǎn)是能使用腐蝕性的顯色劑；但其缺點(diǎn)為薄層的硬度不夠，且不利于無機(jī)物的分離。第二十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2，羧甲基纖維素鈉CMC-Na

先將羧甲基纖維素鈉調(diào)成糊狀，再加足量水?dāng)嚢杈鶆?，并加熱煮沸使盡可能溶解，放置澄清后，取上清液代替水與吸附劑攪勻涂布薄層。常用的濃度為0.2％--1．0％，濃度越高,薄層硬度越大，是常用的粘合劑，但其缺點(diǎn)為不能耐受有腐蝕性的顯色劑。第二十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三3，淀粉

將淀粉配成5%的溶液,在85℃加熱至有粘性,加入適量吸附劑制成薄層.缺點(diǎn)為不能耐受有腐蝕性的顯色劑。4，預(yù)制板粘合劑上述三種粘合劑均于實(shí)驗(yàn)室自制TLC時(shí)使用．商品市售預(yù)制板粘合劑有：聚乙烯醇，聚丙烯醇，聚丙烯酰胺。

5.添加劑

熒光劑;酸、堿或PH緩沖液等。第二十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三三、薄層板的制備當(dāng)前國外商品化的各種預(yù)制板均有市售，可滿足各種需要。（除個(gè)別特殊需要人工制板外）預(yù)制板使用方便,涂布均勻,薄層光滑及有很好的牢度.預(yù)制板有玻璃板、塑料板或鋁箔板，后兩種還有剪裁方便之優(yōu)點(diǎn)。國外市售預(yù)制板較多，包括普通薄層預(yù)制板（硅膠、氧化鋁、纖維素、硅藻土、聚酰胺、離子交換纖維素、鍵合硅膠反相板）；高效薄層預(yù)制板（、鍵合硅膠預(yù)制板、手性預(yù)制板）等，規(guī)格眾多，尺寸不同，分離效果及重現(xiàn)性均較手工制板好。國內(nèi)預(yù)制板規(guī)格類型較少，進(jìn)口又貴，所以主要靠自己手工制作。第三十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三1，載板的制備：常用載板主要為玻璃板，塑料板，金屬鋁箔等較少應(yīng)用載板必須是表面光滑，平整清潔玻板大小視實(shí)驗(yàn)所需而定。一般分析用：3×5cm；4×20cm；10×10cm,制備用：20×20cm，20×40cm第三十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2，薄板涂鋪方法（1）干法鋪板

將吸附劑直接倒在板上一端，取一適當(dāng)玻棒兩端包裹上適當(dāng)厚度的橡皮膏或塑料管，視薄層厚度要求而定。用力移動(dòng)玻璃管，（用力不可過猛或太快，也不能中途停止，以免薄層厚薄不均）如此制成的薄板稱為軟板。由于該板易吹散，現(xiàn)已比較少用，多用硬板。第三十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第三十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

（2）濕法鋪板：一般都要加黏合劑，故稱粘合薄層板（硬板）。常用兩種硬板為：硅膠+G、硅膠+CMC-Na硅膠G板鋪制。G的含量為10－13％，制板時(shí)每份硅膠G

+水2－3份，研成糊狀，倒在板上鋪布。硅膠CMC-Na板鋪制:硅膠H或硅膠G+CMC-Na水溶液（0.5％）（1：3），研成糊狀，倒入板上鋪布。第三十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三0.5％CMC-Na配制：取適量CMC-Na+蒸餾水加熱煮沸，完全融解，放冷靜置。鋪板時(shí)取其上清液使用。鋪板時(shí)為了防止由于攪拌而帶入氣泡，常常加入少量乙醇或丙酮或?qū)⑽絼┖紫戎糜谡婵崭稍锲髦袦p壓脫氣，以免薄層表面出現(xiàn)氣泡，影響分離效果。其他一些加黏合劑鋪層的處理方法見有關(guān)參考書。第三十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三濕法鋪板方法操作：①

傾注法：取適量調(diào)好的吸附劑糊，倒在干凈的薄板上用玻棒涂成一均勻薄層，再稍加震動(dòng)，使薄層平整均勻。置水平臺(tái)上晾干，嚴(yán)防灰塵沾污。再置烘箱中110℃活化一小時(shí)，置干燥器中備用。本法均勻度較差，一致性差，適于小板的制備.②

平鋪法：在水平的較大玻璃上放上要鋪的薄板。薄板兩邊加上做好的框邊，倒上吸附劑糊，用一玻璃板或玻棒向一個(gè)方向均勻的將吸附劑刮平，然后輕輕震動(dòng)均勻，置于平臺(tái)上晾干，活化備用。適于大板的制備。第三十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第三十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三（3）機(jī)械涂鋪法：手動(dòng)涂布器，自動(dòng)涂布器。由于手動(dòng)推進(jìn)速度不同，使厚度不均勻。鋪板機(jī)國產(chǎn)進(jìn)口皆有，可調(diào)節(jié)制成厚度不同的薄層，供分析與制備用。刮板厚度分別為：0.3,0.4,0.5和0.6mm(固定相干燥縮水后的相應(yīng)的薄層厚度為:0.15,0.2,0.25和0.3mm)一般用于分析的薄層厚度為0.25－0.5mm,用于制備的薄層厚度為0.5－2mm。第三十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第三十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三注意：

ⅰ吸附劑在手工調(diào)制時(shí)，研磨的方向順一個(gè)方向，否則凝固不均勻。ⅱ涂布速度要快，避免固定相過度凝固，使涂布困難ⅲ涂布時(shí)速度保持一致ⅳ涂布后的薄層應(yīng)水平放置，室溫晾干備用，避免因通風(fēng)導(dǎo)致產(chǎn)生裂紋，避免灰塵沾污。ⅴ活化時(shí)一般硅膠板105－110℃,0.5-1小時(shí)。有些薄層板不必活化，晾干即可用，如聚酰胺板。第四十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第四十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三四、上樣上樣是制備薄層分離的最關(guān)鍵步驟之一。1.溶解：上樣前，先將樣品溶于少量溶劑中，低揮發(fā)性的溶劑可引起點(diǎn)樣帶擴(kuò)散變寬。因此最好選擇揮發(fā)性溶劑（二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，醇），避免用水，DMF,DMSO等不易揮發(fā)易擴(kuò)散的溶劑。樣品濃度應(yīng)在5－10％左右，定性0.01－1％范圍。濃度過高易造成超載，出現(xiàn)拖尾或重疊，影響分辨率和分離度。第四十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2.

方法：⑴手工點(diǎn)樣：毛細(xì)管（分析），滴管或注射器。定性點(diǎn)樣：一般點(diǎn)狀點(diǎn)樣，要求圓而小、點(diǎn)樣時(shí),點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑最大不得超過5mm，一般以2－3mm較為合適；高效板斑點(diǎn)直徑約為1－2mm.若需重復(fù)點(diǎn)樣,應(yīng)待上次點(diǎn)樣的溶劑揮發(fā)后,在重復(fù)點(diǎn)樣。以防點(diǎn)樣點(diǎn)過大,造成拖尾、擴(kuò)散等現(xiàn)象。影響分離效果。第四十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三制備點(diǎn)樣：一般帶狀（線狀）點(diǎn)樣，要求窄又細(xì),以獲得較好的分離效果。點(diǎn)樣后必須將溶劑吹干再進(jìn)行展開，但要避免高溫加熱，使成分分解。對(duì)于制備薄層，若點(diǎn)樣帶較寬，可先用較大極性溶劑，將薄層板展開到點(diǎn)樣帶上端2cm處，以起到濃集作用。然后將薄板干燥后，再用展開劑展開

第四十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三⑵自動(dòng)點(diǎn)樣儀：點(diǎn)樣不觸及薄層，用氮?dú)獯蹈伞５谒氖屙?，共一百零五頁，編輯?023年，星期三

3.位置:經(jīng)典薄層起始線距底邊約1-1.5cm,高效板1cm，展距前者為10－15cm，后者為5－7cm；點(diǎn)間距經(jīng)典薄層1－2cm，高效板0.5cm,第四十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三4.上樣量:1.0mm厚的硅膠板或氧化鋁板最多可上樣5mg/cm,對(duì)20×20cm板可最高分離10－100mg樣品。如果吸附劑的厚度加倍，可多上樣。切勿超載，出現(xiàn)拖尾或重疊，影響分辨率和分離度。第四十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三五、展開劑選擇PTLC所用展開劑的條件由分析型TLC預(yù)試來確定。由于兩者所用吸附劑的顆粒大小相同，所以分析型TLC展開劑可直接用于PTLC.薄層色譜條件是依據(jù)被分離組分的性質(zhì)（溶解度，酸堿性，極性）吸附劑（活性）以及展開劑極性三個(gè)因素決定的。在上述三個(gè)因素中，被分離物質(zhì)是固定的，吸附劑常用的種類也不多，而展開劑種類則是千變?nèi)f化。不僅可以應(yīng)用不同極性的單一溶劑作為展開劑，更多的是應(yīng)用不同極性的混合溶劑。所以對(duì)于特定物質(zhì)的分離，展開劑對(duì)分離起決定作用。

第四十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三1.

溶劑強(qiáng)度：是指單一溶劑或混和溶劑洗脫某種溶質(zhì)的能力.在正相色譜中，它隨極性增大而增大?！獦O性小的溶劑，對(duì)極性小的組分溶解強(qiáng)，在TLC中能較快的向前遷移，與極性大的組分分離。極性小組分的Rf比極性大組分的大?！獦O性大的溶劑，對(duì)極性大的組分溶解強(qiáng)，較快向前遷移，而與極性小的組分分離。極性大組分的Rf比極性小組分的大。第四十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三常見溶劑極性順序石油醚（petro）<環(huán)己烷(Cyclohex)<正己烷(Hex)<二硫化碳（CS2）

<四氯化碳(CCl4)<三氯乙烷(CH3CCl3)<苯（Ph）<甲苯（Toluene）<二氯甲烷(CH2Cl2)<氯仿(CHCl3)<乙醚(Et2O)<乙酸乙酯(EtOAc)<丙酮(Acetone)<正丙醇<乙醇(EtOH)<甲醇(MeOH)<吡啶(Py)<羧酸(R-COOH)<水第五十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三在實(shí)際操作中，一般按極性順序選單一溶劑展開，看其Rf及分離效果，另加入第二種、第三種溶劑來調(diào)節(jié)之。Rf最佳范圍為0.2－0.5，可使用范圍為0.2－0.8。第五十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三對(duì)極性化合物，如果Rf太小，可加極性較大溶劑；如果太大，可加非極性溶劑。當(dāng)樣品中含有碳基時(shí)，在非極性溶劑中加入少量丙酮；當(dāng)樣品中含有羥基時(shí)，于非極性溶劑中加入少量甲醇、乙醇等；當(dāng)含有羧基酸性樣品時(shí)，可加入少量的甲酸、乙酸；當(dāng)含有氨基的堿性樣品時(shí)，可加入少量六氫吡啶、二乙胺、氨水等，可改善拖尾的出現(xiàn)，提高堿性或酸性化合物的分離效果?？傊?，加入的溶劑應(yīng)與被測物的官能團(tuán)相似。第五十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三下列是幾種常用的兩相溶劑系統(tǒng)（不同比例）正己烷：乙酸乙酯環(huán)己烷：乙酸乙酯正己烷：丙酮石油醚：乙酸乙酯氯仿：甲醇丙酮：甲醇石油醚：苯（甲苯）正己烷：苯（甲苯）第五十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第五十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三聚酰胺薄層溶劑洗脫順序：聚酰胺薄層單一溶劑洗脫能力的順序:在聚酰胺薄層上的分離是由于氫鍵的形成能力，這決定于化合物本身及展開劑的極性，在水中形成氫鍵的能力最強(qiáng)，在有機(jī)溶劑中形成氫鍵能力較弱，在堿性溶液中形成氫鍵能力最弱，因此在聚酸胺薄層上單一溶劑洗脫能力的順序是：水＜乙醇＜甲醇＜丙酮＜稀氫氧化銨（鈉）溶液＜甲酸胺＜二甲基甲酸胺第五十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三常用的多元展開劑有：水一乙醇（50:50）、水一甲醇（50:50）、水一丁酮一甲醇（40:30:20）、水一乙醇一丁酮一乙酰丙酮(15:15:15:5）、水一乙醇一乙酸一二甲基甲酰胺（30:20:10:5）、苯一甲醇一丁酮（60:20:20）等第五十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2.選擇展開劑的方法

⑴三角形法

⑵點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法

⑶CamagVario-Ks展開室法

第五十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三⑴三角形法。按照展開劑，固定相及被分離物質(zhì)三者間相互影響,設(shè)計(jì)了三因素綜合幫助選擇展開劑的極性和固定相的活度。圖（a）適于吸附薄層;圖(b)適于分配薄層.

第五十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三⑵點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)法

本法非常簡單,也很實(shí)用.將要被分離的化合物溶液間隔的點(diǎn)于薄層板上,待溶劑揮發(fā)干后,用不同的展開劑通過毛細(xì)管點(diǎn)到各樣品點(diǎn)上,借毛細(xì)管作用,展開劑從圓心向外擴(kuò)展,這樣就出現(xiàn)了不同圓心的色譜,經(jīng)過比較就可以發(fā)現(xiàn)最合適的展開劑及吸附劑.第五十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三下圖是證明苯是最合適的展開劑.第六十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三⑶CamagVario-Ks展開室法CamagVario-Ks展開室至少有5個(gè)溶劑室,可以在同一薄層板上同時(shí)篩選至少5種展開劑.用此裝置可以很快找到最合適的展開劑及最佳展開條件。第六十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三六、薄層展開薄層展開要在密閉的器皿中進(jìn)行，如廣口瓶或其它帶有蓋子的玻璃瓶都可作為展開器。加入展開劑的高度為0.5-1.0cm。第六十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三1.預(yù)飽和：可在展開器中放一張濾紙，以使器皿內(nèi)的蒸氣很快地達(dá)到氣液平衡，待濾紙被展開劑飽和以后，把點(diǎn)有樣點(diǎn)的板(樣點(diǎn)一端向下)放入展開器內(nèi)。也可使用薄層雙槽展開室，加入展開劑于其中一槽，把點(diǎn)有樣品的板放入無展開劑的另一槽內(nèi)。若使用平底展開室，可將展開室一端墊高，將薄板置于展開室墊高一端，蓋好蓋子，使薄板飽和之。時(shí)間自行掌握，半小時(shí)左右。第六十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第六十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第六十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2.展開：視薄層形狀而定硬板常用上行展開，環(huán)形展開，雙向張開，下行展開，多次展開軟板常用近水平展開第六十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第六十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三采用多次展開的方法可以提高TLC的分離效果。在一次展開結(jié)束后，先將薄板干燥，再放入容器中展開。多次展開可分為單向多次展開（同一種展開劑，以增加展開距離）與梯度展開（不同種展開劑，以增加分離度）。第六十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三上行展開實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用較多展開時(shí)薄層板并與器皿成一定的角度，同時(shí)使展開劑的水平線應(yīng)在樣點(diǎn)以下，蓋上蓋子。當(dāng)展開劑上升到離板的頂部約lcm處時(shí)取出，并立即用鉛筆標(biāo)出展開劑的前沿位置，待展開劑干燥后，觀察斑點(diǎn)的位置。第六十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三七、檢測方法1．光學(xué)檢測2.蒸汽檢出3.顯色法4．加入?yún)⒄瘴锓ǖ谄呤?，共一百零五頁，編輯?023年，星期三1．光學(xué)檢測可見光：一些化合物如染料，蒽醌等對(duì)可見光有吸收，因此在自然光下呈現(xiàn)不同顏色的斑點(diǎn)。UV法：多數(shù)化合物在可見光下不能顯色，但可吸收UV光，在紫外燈下顯示出不同顏色的斑點(diǎn)。熒光法：—些化合物吸收UV光后，激發(fā)出熒光，在色譜上呈現(xiàn)不同顏色的熒光斑點(diǎn)。熒光萃滅法：無UV－可見光和熒光者，可將樣品點(diǎn)于含有無機(jī)熒光劑的薄層板上，展開后揮去溶劑，置UV燈下觀察，被分離的化合物在有色的熒光的背景下，呈現(xiàn)暗的斑點(diǎn)。第七十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三如GF254與HF254板在黃綠熒光背景下出現(xiàn)黑斑。這是由于這些化合物減弱了吸附劑中熒光物質(zhì)的UV吸收，引起了熒光萃滅。也可以將熒光素噴于無熒光劑的薄層板上，獲得與熒光板相同的效果。第七十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2.蒸汽檢出。利用一些物質(zhì)的蒸氣與樣品作用，產(chǎn)生不同顏色或產(chǎn)生熒光。I2熏色是實(shí)驗(yàn)室常用方法，展開后的薄層板揮去溶劑，放在盛有I2結(jié)晶的密閉容器中，大多數(shù)化合物吸附I2蒸氣后，呈現(xiàn)不同程度的黃褐色色斑。標(biāo)出斑點(diǎn)位置，借此檢出所分離的化合物位置。當(dāng)薄層離開I2蒸氣后，黃褐色色斑逐漸消退。這是可逆反應(yīng)，不影響產(chǎn)物性質(zhì)。若不退色，為不可逆反應(yīng)，只可用于定性，對(duì)化合物制備不可取。第七十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第七十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三3.顯色法：若化合物對(duì)UV－可見和熒光均不能顯示斑點(diǎn)，可加入顯色劑顯色。常用噴撒法、浸漬法，展層顯色法等。顯色法主要用于定性分析定位，制備型較少應(yīng)用。顯色劑分兩大類：一類為檢查一般有機(jī)化合物的通用試劑；另一類為根據(jù)化合物或特殊官能團(tuán)設(shè)計(jì)的專屬性顯色劑。種類繁多。第七十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常備用兩種顯色劑高錳酸鉀溶液（高錳酸鉀9克+氫氧化鈉0.75克+碳酸氫鈉60克+水900毫升）——氧化性試劑茴香醛溶液（674毫升乙醇+18.5毫升茴香醛+25毫升濃硫酸）——還原性試劑第七十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三4．加入?yún)⒄瘴锓▽?duì)于PTLC法，若對(duì)UV－可見和熒光均不能顯示斑點(diǎn)，因不能碘薰色、不能加顯色劑等，可利用參照物的Rf值，確定被分離化合物的位置。第七十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

化合物的檢出除用于鑒定、分離外，可用于監(jiān)測有機(jī)反應(yīng)進(jìn)行的的情況，以尋找化學(xué)反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)間和達(dá)到最高反應(yīng)的收率。第七十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三八、被分離物質(zhì)的收集在確定色帶位置后，可用刮刀或用與真空收集器相連的管狀刮離器，將色帶吸附劑從板上刮下。后一種方法對(duì)易氧化的物質(zhì)持續(xù)與空氣接觸，慎用。第七十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第八十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三將回收的吸附劑以極性較低的溶劑，使化合物從中提取出來（1克吸附劑約用5毫升溶劑）.注意:化合物與吸附劑接觸時(shí)間越長，被破壞可能性也越大?？上扔?型沙芯漏斗過濾洗脫液，然后用濾模（0.2-0.45um）過濾。甲醇可溶解硅膠及其中一些物質(zhì)，所以不適用于作展開劑及從硅膠上洗脫被分離的化合物。常用溶劑：丙酮，乙醇，氯仿等.

第八十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三九、PTLC分離化合物的純化PTLC過程中，因吸附劑中含有黏合劑及熒光指示劑，在溶劑提取過程中，吸附劑中雜質(zhì)易被提取，洗脫液極性越大，提取的可能雜質(zhì)越多。這些雜質(zhì)往往無UV吸收，TLC檢測難以發(fā)現(xiàn)其存在。因此溶液蒸去后，往往要經(jīng)重結(jié)晶處理或相應(yīng)的手段進(jìn)行再純化，方可通過含量測定及光譜分析要求。第八十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三

第二節(jié)

離心薄層色譜

CentifugalLiquidChromatography

離心液相薄層是制備薄層的一種改進(jìn)。因?yàn)榻?jīng)典的制備型PTLC存在著許多缺陷，如展開過程太長；需要將被分開的化合物從薄層上刮下，提取出來。提取過程易引入吸附劑雜質(zhì)及殘留物等。為克服這些缺點(diǎn)，人們發(fā)明了離心薄層色譜。第八十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三基本內(nèi)容一、離心薄層色譜的技術(shù)原理二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀三、應(yīng)用實(shí)例

第八十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三一、離心薄層色譜的技術(shù)原理是一種強(qiáng)制性流動(dòng)相移動(dòng)方法。主要是在經(jīng)典的PTLC基礎(chǔ)上，即樣品在固定相和流動(dòng)相間的吸附，分配作用的不同，再加上離心力的作用，使流動(dòng)相加速流動(dòng)，使樣品各組分之間原有的Rf差異加大，從而提高了分離效果，加快了分離速度。由于CLC儀器簡單，操作簡便，分離效果好等優(yōu)點(diǎn)，而廣泛用于合成和天然產(chǎn)物的制備分離。第八十五頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三二、旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀

目前旋轉(zhuǎn)薄層色譜儀有2種類型：一種是美國Harrison的7924型Chromatotron儀及我國北京青云儀器廠生產(chǎn)的LBC－1型離心薄層色譜儀；另一種是日本日立公司生產(chǎn)的CLC型離心薄層色譜儀。第八十六頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第八十七頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第八十八頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三第八十九頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三（一）Chromatotron儀旋轉(zhuǎn)圓盤為傾斜的，核心部分是一直徑為24厘米，鋪有吸附劑的玻璃圓盤。1.旋轉(zhuǎn)薄層的制備常用硅膠為吸附劑。為防止薄層開裂常加石膏G或羧甲纖維素鈉為粘合劑。第九十頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三例如：在多數(shù)情況下，利用硅膠制備2毫米厚的薄層。將薄層色譜硅膠60F25460克+石膏CaSO4.2H2O8克加水110毫升，劇烈振搖30秒。將混合物傾倒在載體玻璃板上，使之旋轉(zhuǎn)向四周擴(kuò)散，最后形成一均勻薄層。在板四周可加一防護(hù)帶，防止吸附劑流出板邊緣。室溫干燥過夜后，置烘箱60－70℃烘1小時(shí)。冷后，用一固定于中心的刮離器，可將吸附劑表面刮平，在中央留一空白處，用以倒入洗脫劑。第九十一頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三2.層析過程將制備板（厚度1，2，4毫米）用螺絲固定在電動(dòng)機(jī)軸心上，以800r/min速度轉(zhuǎn)動(dòng)。輸出量1－10毫升/分輸液泵。將洗脫液加至吸附劑中央空白處。通過離心力作用，使洗脫液流經(jīng)薄層板。先用洗脫液沖洗薄層板，以除去吸附劑中雜質(zhì)，隨后有兩種操作方式①直接加入樣品②干燥后再加入樣品，然后開始洗脫，流速3－6毫升/分。圓形色譜板上展開的圓形色譜帶可借UV燈檢出，覆蓋的石英玻璃不防礙UV穿過。有時(shí)可持續(xù)通氮?dú)馊肷V室中，以防洗脫液凝結(jié)和樣品被氧化。第九十二頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三加入樣品后，隨洗脫液的洗脫，可得到各組分濃縮的同心圓狀色譜，通過肉眼可直接觀測到。見圖在色譜板邊緣，色帶快速脫離色譜板，流出管外，從而能選擇性收集之。

第九十三頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三3.色譜條件選擇用硅膠作吸附劑，洗脫劑選擇：一般要求將分析薄層色譜條件的Rf調(diào)至0.5以下，否則將相同洗脫溶劑用于離心薄層時(shí)，洗脫速度太快。實(shí)驗(yàn)證明一個(gè)2mm厚的薄層，可分離50－500mg的混合物?？蓱?yīng)用梯度洗脫法，提高產(chǎn)品洗脫分離速率。第九十四頁，共一百零五頁，編輯于2023年，星期三(二)、日立HitachiCLC-5離心色譜儀使用之前，先將吸附劑與洗脫劑混合物加到兩塊直徑為30厘米的水平薄板之間，像Sandwich一樣。離心使過量溶劑排出，然后將樣品混合物加到仍潮濕的吸附劑薄層上，采