逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)中的細(xì)節(jié)問題

關(guān)于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)中的細(xì)節(jié)問題第一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三RT-PCR原理第二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三實驗器具與材料試劑

標(biāo)本收集與保存

RNA抽提逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)介紹內(nèi)容第三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三一、實驗器具、材料1、移液槍：1ml、200μl、20μl

2、吸頭及吸頭盒：1ml、200μl、20μl（無菌無酶，可直接購買）

3、EP管：1.5ml（無菌無酶，可直接購買）4、PCR薄壁管0.2ml

5、普通EP管：1.5ml、O.5ml（高壓滅菌）

6、大瓷缸：2個（180℃的高溫干烤6h，滅活RNA酶，存放無酶EP管和PCR管）

7、組織搗碎棒（可直接購買）第四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三1、DEPC水500ml。

2、75%乙醇：用無水乙醇DEPC水配，然后放4℃保存

3、異丙醇

4、氯仿

5、電泳緩沖液(TAE/TBE)

7、瓊脂糖

8、Taq酶（含MgCl2Buffer）,-20℃

9、dNTP,-20℃

10、隨機引物,-20℃

11、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Buffer),-20℃

12、RNasin,-20℃

13、Trizol100ml/1瓶,-4℃

14、Marker,-20℃

15、引物,-20℃

二、試劑第五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三三、標(biāo)本收集與保存

1、細(xì)胞：懸浮細(xì)胞：1500rpm,5min離心，取沉淀-80℃凍存，或直接抽RNA;

貼壁細(xì)胞：倒掉培養(yǎng)液，加Trizol1ml,溶解細(xì)胞，直接抽RNA或凍存（如沒有Trizol，可用胰酶消化后，同懸浮細(xì)胞處理）2、組織：液氮取材（越快越好），-80℃凍存：即可用于抽RNA,也可用于抽蛋白；

RNA保護劑取材:用普通冰袋即可，但不宜用于抽蛋白；

Trizol取材：同上；

-80℃冰袋取材：沒辦法的辦法。

目的：防止RNA被RNA酶降解措施：低溫、RNA酶抑制劑、盡快取材防止細(xì)胞裂解第六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三四、RNA抽提

目的：防止RNA被RNA酶降解，獲得高質(zhì)量的RNA措施：1.了解RNA酶的來源及應(yīng)對方法：（1）內(nèi)源性：組織細(xì)胞裂解釋放（低溫、RNA酶抑制劑）（2）外源性：實驗者的皮膚分泌物、呼吸氣體、唾液等（帶手套、口罩）；（3）實驗環(huán)境中的灰塵、微生物等（環(huán)境清潔、消毒、在超凈臺內(nèi)進(jìn)行）；（4）實驗器械（進(jìn)行無酶處理）：180℃的高溫下干烤6h；0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具不能使用）；用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制溶液。第七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三2、了解RNA抽提的步驟原理，知道哪些是需要注意RNA酶污染的關(guān)鍵步驟，做到膽大心細(xì)。舉例如下：TRIREAGENT分離RNA

PROTOCOL1）5～10×106細(xì)胞沉淀，加TRIReagent1ml,反復(fù)吹打?qū)⒓?xì)胞溶解。

50-100mg組織加1mlTRIReagent于勻漿器中勻漿（注意：標(biāo)本體積不得超過TRIReagent體積的10%）2）將勻漿于室溫靜置5分鐘（此步后將樣本置-80℃至少可保存一個月）3）然后向勻漿中加入0.2ml氯仿,蓋緊樣本劇烈振搖15秒4）將混合物室溫靜置2-15min，12,000g，4℃離心15min（低溫離心很重要，否則，水相中會混入少量的DNA）(離心后原混合物分為底層紅色的酚－氯仿相,中間相和上層無色的水相。RNA存在于水相，而DNA和蛋白質(zhì)分別存在于中間相和有機相。水相的體積大概占用于勻漿的TRIReagent總體積的60%。)5)轉(zhuǎn)移上層無色的水相至新的管子中,加0.5ml異丙醇（從水相中沉淀RNA），室溫靜置5-10分鐘6)12,000g，4℃離心8min.此時可見RNA沉淀(離心前通?？床灰?于管底或側(cè)壁形成膠凍狀或白色沉淀。第八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三7)移去上清，加至少1ml的75%乙醇洗滌RNA沉淀(用渦旋)，（此時RNA可至于75%乙醇中存于4℃至少一周或存于-20℃至少一年）8)然后于7,500g，4℃離心5min（如

RNA沉淀積于管壁一側(cè)和傾向于漂浮，于12,000g沉淀）9)移去上層的乙醇洗液，將RNA沉淀置空氣中短時干燥.（注意不要讓RNA沉淀完全干燥，因為這樣將極大的降低其可溶性。但對于用于RT-PCR的樣本而言，應(yīng)盡量讓RNA樣本中的乙醇揮發(fā)，這對5-20微升的小體積樣本尤其重要）

10)用30-50mlRNase-free的水溶解RNA幾分鐘，可用吸頭吹幾下（如還不溶于55-60℃孵育10-15分鐘）11)濃度質(zhì)量檢測所需試劑：TRIReagent（MolecularResearchCenter,INC.，Cat.No.TR118）RNase-free的水（上海生工Cat.No：D1005－100ml）氯仿、異丙醇、乙醇所需器材：組織搗碎棒（RNase-free，上海華舜Cat.No：W1220）RNase-free，1.5ml離心管1ml，200微升、20微升tip（RNase-free，已消毒盒裝)第九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三3、RNA質(zhì)量檢測1）檢測RNA溶液的吸光度OD260/OD280=1.8~2.0表示優(yōu)質(zhì)（280、260nm下的吸光度分別代表了核酸、和蛋白值），并可以檢測濃度;2）RNA的電泳圖譜：檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰，并且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，RNA的質(zhì)量是好的;3）保溫試驗（檢測有無微量RNA酶殘留）4)直接逆轉(zhuǎn)為cDNA，進(jìn)行管家基因（如b-actin）PCR，瓊脂糖電泳后，如有相應(yīng)的產(chǎn)物條帶，則說明RNA可以使用5、RNA保存：-80℃凍存；或逆轉(zhuǎn)為cDNA保存（更安全）4、DNA污染的檢測與處理1）檢測方法：

a:用沒有逆轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR，有產(chǎn)物生成，提示污染

b:設(shè)計上下游引物，使其與DNA互補位點之間包含內(nèi)含子，來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于沾染的基因組DNA的產(chǎn)物短2）處理：在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理第十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三五、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

目的：以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA措施：1.獲取優(yōu)質(zhì)的RNA;2.采用優(yōu)質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄酶

AMV(禽成髓細(xì)胞瘤病毒)：逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶H活性。最適42℃。

MMLV(Moloney鼠白血病病毒)：逆轉(zhuǎn)錄酶活性強，RNA酶H活性較弱。最適37℃或42℃。

3.引物選擇:隨機引物:適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的RNA,特異性最低;。

Oligo(dT)：適用于具有PolyA尾巴的RNA

特異性引物：與目的序列互補，是反義寡核苷酸，適用于目的序列已知的情況

4、質(zhì)量檢測：進(jìn)行管家基因（如b-actin）PCR5、產(chǎn)物保存：-20℃第十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三First-StrandSynthesisofcDNA舉例1.試劑(1)M-MLVReverseTranscriptase(200u/ul)（promega，Catalog#M1701)(2)M-MLV5×ReactionBuffer(3)rRNasin(40u/ul)（promega）(4)dNTP(10mMeach)（生工）(5)RandomPrimers（生工）(6)Nuclease-FreeWater2.操作步驟（1)TotalRNA2ugPrimer(0.5ug/ul)2ulNote:0.5ug/ugmRNANuclease-FreeWater11ulAddto15ul70℃，5分鐘以溶解模板的二級結(jié)構(gòu)，取出立即置冰上冷卻（防止二級結(jié)構(gòu)重新形成），簡單離心。第十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三M-MLV5×ReactionBuffer5uldNTP(10mMeach)1.25ulrRNasin(40u/ul)0.6ul=25uM-MLVReverseTranscriptase(200u/ul)1ulNuclease-FreeWater2.15ulTotalVolume25ul輕彈PCR管，使其混勻，簡單離心。（3）在PCR儀上執(zhí)行37℃60min（RandomPrimers，其它引物如Oligo(dT)用42℃）。（4）70℃10分鐘后進(jìn)行PCR或－20℃保存?zhèn)溆?。?）在冰上依次加入下列試劑：第十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三六、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)

目的：以cDNA為模板大量擴增目的基因片段措施：1.合適的PCR引物;2.合適的Taq酶；3.PCR條件的優(yōu)化第十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三PCR引物設(shè)計原理第十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三PCR引物選擇與設(shè)計引物選擇與設(shè)計1.引用文獻(xiàn)（影響因子較高的雜志或使用頻率較高）;2.找引物合成公司設(shè)計；3.自己設(shè)計:目的不同引物要求也不同：1.用于分子克隆的引物：應(yīng)涵蓋目的基因全長，引入酶切位點；2.用于定性或半定量的PCR引物：涵蓋部分目的基因即可（>200bp)；3.用于real-timePCR的引物：涵蓋的目的基因不宜太長（150-250bp)第十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三

用PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計舉例

以大鼠olig2的引物設(shè)計為例1、查找大鼠olig1mRNA堿基序列第十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三2、用PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計

第十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三四種重要指標(biāo)：發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)、二聚體(Dimer)、錯誤引發(fā)情況(FalsePriming)、上下游引物之間二聚體形成情況(CrossDimer)第二十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第二十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三Sense:5'ACCTCCGACGCCAAGTGA3‘Anti-sense:5'CGGTTCCCAAATAATACGC3'4、引物同源性分析（用Blast進(jìn)行同源性比較）

檢查引物的特異性3、PrimerPremier5.0設(shè)計的大鼠olig2引物第二十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十二頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十三頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十四頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十五頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三5、Blast進(jìn)行同源性比較，確認(rèn)引物的特異性后，聯(lián)系公司，合成引物6、引物的溶解和稀釋上下游引物干粉各加適量消毒雙蒸水(滅菌注射用水)稀釋至20μM,-20℃保存.第三十六頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三PCR舉例第三十七頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三注意：此PCR反應(yīng)條件中缺預(yù)變性（94℃，5min)和最后的產(chǎn)物延伸（72℃，10min)第三十八頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三第三十九頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三DNA瓊脂糖凝膠電泳

準(zhǔn)備試劑：1．電泳緩沖液：(TBE或TAE均可）(1)5×TBE:Tris54gBoricAcid27.5g0.5mol／LEDTA200mLpH=8.0定容至1000ml。(2)50xTAE

Tris

242g

冰醋酸

57mL

0.5mol／LEDTA200mL

pH8.0

定容至1000ml。

2．凝膠加樣緩沖液(6×)

3．瓊脂糖

4．溴化乙錠溶液(EB)10mg／mL

5．DNA分子量Marker

第四十頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三實驗步驟⑴配膠（1﹪瓊脂糖凝膠）0.3g瓊脂糖加入30ml0.5×TBE中，搖勻；在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解；冷卻到60℃，加入3μl的EB，并搖勻.⑵制膠：把梳子插入制膠槽相應(yīng)位置，將融解的瓊脂糖倒入，室溫冷卻凝固，垂直向上拔出梳子，將凝膠連同膠槽置入電泳槽中，加0.5×TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。(3)點樣：用移液搶吸取PCR產(chǎn)物5μl于塑料紙上，再加入1μl的6×加樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。(4)電泳：（由負(fù)極向正極電泳）打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)至合適電壓(一般電場強度不要超過5V／cm)；可見到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動，電泳約15min-30min。(5)觀察：關(guān)掉電源，將凝膠小心的從電泳槽中取出，置于紫外透射檢測儀上觀察，拍照，并分析。第四十一頁，共四十九頁，編輯于2023年，星期三PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化（一）PCR反應(yīng)的緩沖溶液提供合適的酸堿度和某些離子10～50mmol/LTris-HCl緩沖液50mmol/LKClBSA或明膠（二）鎂離子濃度Taq酶活性需要Mg2+，Mg2+濃度過高導(dǎo)致非特異擴增。一般常用1.5mmol/L三）底物濃度dNTP濃度在20～2