色譜柱的故障診斷與維護

色譜柱的故障診斷與維護液相色譜柱部分北京八方世紀科技有限公司請訪問中國色譜網(wǎng)(www.SeP)1I.常見問題基線噪音可能的原因：流動池臟檢測器燈有問題如果是周期性的，則起源于泵的脈沖溫度對檢測器的影響氣泡經(jīng)過檢測器Time(min.)2基線漂移梯度洗脫溫度不穩(wěn)定(示差檢測器）流動相中有污染物柱中的流動相沒有平衡體系中有污染物流出可能的原因：3鬼峰鬼峰——即使不進樣也會出現(xiàn)的峰20%-100%MeOH沒有進樣601530150371517問題1-流動相臟問題2-樣品過量(也可能是回收率太差)4峰型雙峰柱塌陷正常峰雙峰柱中有死體積

過濾片部分堵塞只有一個雙峰——組分的共洗脫可能原因：樣品與溶劑不匹配5峰型所有的峰都展寬柱效降低——柱死體積大進樣量

/質(zhì)量高粘度流動相部分峰展寬前次進樣后流出的組分大分子量樣品——蛋白或聚合物峰展寬樣品與流動相不匹配6峰型拖尾峰不對稱性

>1.2NormalTailingNormalTailing原因：部分峰拖尾二次保留效應(yīng)——殘留硅醇基的反應(yīng)小峰緊跟在大峰的后面流出柱頭有污染金屬所有峰拖尾額外的柱效應(yīng)柱損壞不適當?shù)臉悠妨?溶劑7峰型正常峰伸舌峰前伸峰不對稱性

<0.9可能的原因柱過載在大峰前，有小峰流出樣品溶劑不適當柱死體積過濾片部分堵塞8峰型原因樣品的吸收比流動相的吸收值低當樣品組分通過色譜柱時打破了原來的平衡用示差檢測器時是正常的9寬峰柱外體積增加*在進樣口到柱或柱到檢測器之間，使用細的短的連接管*

保證所有的管路接頭都使用正確*

用小體積檢測池*

減少進樣量10柱外體積效應(yīng)的影響0

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1011柱外體積10μL20μLTime,min.2.1x150mmF=0.2mL/min.(1ul進樣)11I.不進樣時柱壓連續(xù)升高-泵密封墊-流動相有顆粒-流動相溶解性-流動相的不穩(wěn)定性

(聚合)-形成柱死體積

(與使用條件有關(guān))II.進樣時壓力升高-樣品有顆粒-

樣品在流動相中不溶-樣品組分與固定相不兼容壓力12I.所有峰都向低保留值方向漂移（酸、堿、中性化合物）-鍵合相流失-流動相不穩(wěn)定

(可能性較小)-溶劑輸送系統(tǒng)

(流速變化)II.所有峰都向高保留值方向漂移-在水/有機溶劑的混合體系中，有機溶劑含量減少-

柱改變

(可能性較小)-溶劑輸送系統(tǒng)

(流速變化)III.離子型化合物的色譜峰的保留值漂移-流動相中揮發(fā)性組分損失(離子強度,pH漂移)-

柱改變

(鍵合相或污染)保留值漂移13I.與流動相有關(guān)的問題-使用新鮮的流動相

?pH ?電導(dǎo)

?色譜性能測試II.與色譜柱有關(guān)的問題-測試新柱-

用標準的測試混合樣測試新柱-“清洗”

色譜柱后再測-考慮樣品基質(zhì)與使用條件對柱穩(wěn)定性的影響保留值漂移14良好的柱使用規(guī)范使用新鮮的水溶液，并考慮使用生物穩(wěn)定劑（如疊氮化鈉）儲存色譜柱時，應(yīng)沖凈緩沖言，并用有機溶劑飽和色譜柱（乙腈）避免外力損傷色譜柱：彎曲、跌落或?qū)⒔宇^擰的過緊完全潤濕在運輸中變干的色譜柱對含有保留性較強的雜質(zhì)組分的樣品要進行預(yù)處理定期用強極性的溶劑清洗色譜柱清除柱填料的局限性了解溶劑對樣品的溶解性及分離的影響pH溫度化學(xué)兼容性在使用前過濾溶劑15預(yù)柱與保護柱從泵來的流動相預(yù)柱進樣器保護柱分析柱到檢測器預(yù)柱對流動相而言保護柱對色譜柱而言StrippingorConcentratingColumn16AuthoringDivisionNameFileNameSecurityNotice(ifrequired)H帶可重復(fù)使用接頭及完整保護柱的卡套柱無保護柱有保護柱17帶Techtron保護柱的

Zorbax

卡套柱帶整體過濾片的Techtron

保護柱18制備樣品:流動相過濾樣品，以確保其不含有固體微粒用流動相或比流動相極性較弱的溶劑溶解樣品進樣的樣品體積應(yīng)盡量小樣品不溶于流動相樣品溶于流動相真正的環(huán)境樣品樣品的溶解性溶劑強度體積效應(yīng)Contaminant微粒強保留的組分19色譜柱維修/再生——物理阻塞在安裝柱前后測試壓力差如果柱壓力太高，反裝色譜柱，并用10-20倍柱體積的流動相沖洗色譜柱，監(jiān)測壓力變化若出現(xiàn)沉淀

(如：蛋白凝聚、細胞物、聚合物)設(shè)法用相應(yīng)的可溶性溶劑，如

0.1%TFA/80%乙腈,6M鹽酸胍,THF,HFIP若仍無效，應(yīng)考慮更換過濾片20ColumnInletFritCompressionFerruleColumnBodyFemaleEndFittingMaleEndFitting色譜柱故障診斷與排除——更換柱頭過濾片帶手套填料不能變干不要接觸色譜柱體加熱填料會被擠出不要擰的過緊21色譜柱修復(fù)和再生

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化學(xué)變化-I由于鍵合相的水解或硅膠的溶解而造成的色譜柱填料的變化是不可逆的由于污染而產(chǎn)生的色譜柱變化可以通過適當?shù)那逑词怪迯?fù)梯度洗脫的方式

(水->強有機溶劑)通常最有效低pH流動相,如0.1%TFAor0.01MH3PO4,也是有效的升高溫度（60-80℃）226M鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素等溶液可用于清除蛋白質(zhì)的沉積XDB,有機聚合物等填料可使用高pH水溶液

/有機溶液，如：

0.01MNaOH50%異丙醇

/水溶液，硅膠基質(zhì)應(yīng)盡量減少接觸時間

(15-30min).色譜柱的修復(fù)和再生

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化學(xué)變化

-IIExample:

4.6mmIDx15cmZorbax300SB-C18Flowrate:1mL/min;Temp:~80℃A:0.1%TFAinwaterB:0.1%TFAinacetonitrile100%Afor30min.;0-100%Bover30min.;Hold100%Bfor30min.,Returnto100%Ain5min.Repeat3times.23

總結(jié)如果使用時加以注意，大部分的液相色譜柱的問題是可以預(yù)防的-流動相必須是互溶的，無顆粒-使用保護柱和在線過