酶的提取與分離純化

關(guān)于酶的提取與分離純化第一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶的提取與分離純化定義將酶從細(xì)胞或其它酶原料中提取出來(lái)，再與雜質(zhì)分開，而獲得所需酶制品的技術(shù)過程，主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶等。第二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

酶的提取、分離純化技術(shù)路線細(xì)胞破碎酶提取(粗提)酶分離純化酶濃縮酶貯存動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞發(fā)酵液離心分離，過濾分離，沉淀分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結(jié)晶分離等。第三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶的純化過程，約可分為三個(gè)階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein):采樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽提出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各種柱層析法。(3)均質(zhì)酶(homogeneous):目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段第四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一節(jié)細(xì)胞破碎（CellDisruption）細(xì)胞破碎：是通過各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過程。第五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四表4-1細(xì)胞破碎方法及其原理分類細(xì)胞破碎方法

細(xì)胞破碎原理機(jī)械破碎法搗碎法研磨法勻漿法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法反復(fù)凍融法干燥法通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎第六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四化學(xué)破碎法添加有機(jī)溶劑、添加表面活性劑通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎第七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、機(jī)械破碎法

通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力的作用，使細(xì)胞破碎的方法1、機(jī)械搗碎法：器械：搗碎機(jī)。常用于動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉芽等比較脆嫩的組織細(xì)胞破碎，也可用于微生物，特別是細(xì)菌的細(xì)胞破碎。第八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、機(jī)械破碎法2、研磨法器械：研缽、細(xì)菌磨等。設(shè)備簡(jiǎn)單，效率較低，常用于微生物和植物組織細(xì)胞的破碎。第九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、機(jī)械破碎法3、勻漿法器械：勻漿器。通常用于破碎那些易于分散、比較柔軟、顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞，細(xì)胞破碎程度較高，其機(jī)械切力對(duì)酶的破壞也較少，但難于在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。第十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、物理破碎法各種物理因素：溫度、壓力、聲波等的作用，使組織細(xì)胞破碎的方法。多用于微生物細(xì)胞的破碎。第十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、溫度差破碎法利用溫度的突然變化，由于熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎。溫度差破碎法對(duì)那些較脆弱、易破的細(xì)胞破碎效果好，但在酶的提取時(shí)，不能在過高的溫度下操作，以免酶失活。此法難以用于工業(yè)生產(chǎn)。第十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、壓力差破碎法（1）高壓沖擊法（2）突然降壓法取決因素：

a.壓力差

b.壓力減低的速度

c.細(xì)胞種類和生長(zhǎng)期此法對(duì)大腸桿菌等革蘭氏陰性菌效果較佳，最好使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。高壓細(xì)胞破碎機(jī)第十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四步驟：高滲平衡→轉(zhuǎn)入低滲溶液→低滲溶脹破裂

適用范圍：膜結(jié)合的酶、細(xì)胞間質(zhì)酶等的提取無(wú)壁或壁破壞（3）滲透壓差法第十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、超聲波破碎法超聲波：通常人的耳朵可聽到的聲音頻率范圍為16-20kHz，頻率高于20kHz的波。其破碎機(jī)理可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切作用有關(guān)。在超聲波作用下，細(xì)胞膜由于空穴作用而破碎。由于空化作用而使液體形成局部減壓引起液體內(nèi)部發(fā)生流動(dòng)，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力使細(xì)胞膜破裂到達(dá)破碎細(xì)胞的效果。JY92-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（液晶顯示）第十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超聲波細(xì)胞破碎的程度與輸出功率和破碎時(shí)間有密切關(guān)系。影響因素：細(xì)胞濃度、溶液粘度、pH值、溫度以及離子強(qiáng)度等。必須根據(jù)細(xì)胞種類以及酶的特性加以選擇。一般操作條件為：音頻10kHz或20kHz；功率100～150W；溫度0～10℃；pH4～7；處理時(shí)間3～10min，最好間隔幾次操作；細(xì)胞濃度和溶液粘度不宜太高，最好采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行破碎。細(xì)胞濃度一般以1g濕菌體加1～2mL緩沖液為宜。3、超聲波破碎法第十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超聲波破碎法特點(diǎn)：處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)單、快捷、液量損失少、效果好；

是最常用的物理破碎法，特別適用于微生物細(xì)胞的破碎。超聲波振蕩易引起溫度的劇烈上升，操作時(shí)常在細(xì)胞懸浮液中加入冰塊或在夾套中通入冷卻劑進(jìn)行冷卻。第十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四4、反復(fù)凍融法將待破碎的細(xì)胞放在低溫下（-15～-20℃）突然冷凍，然后在室溫（或40℃）下緩慢地融解，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。只適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破損率低，常需反復(fù)多次。在凍融過程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。第十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四5、干燥法多種方法使細(xì)胞干燥，如氣流干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。通過干燥使細(xì)胞壁膜的結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。干燥法條件變化劇烈，容易引起蛋白質(zhì)或其他活性物質(zhì)變性。第十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、化學(xué)破碎法應(yīng)用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)改變或破碎的方法。某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁和膜的通透性（滲透性），從而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。第二十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、化學(xué)破碎法化學(xué)破碎法取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同化學(xué)試劑對(duì)各種微生物作用的部位和方式有所不同。常用的化學(xué)試劑：有機(jī)溶劑和表面活性劑

第二十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、有機(jī)溶劑能破壞細(xì)胞壁中的類脂。常用試劑：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等?？墒辜?xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的透過性，再經(jīng)提取可使膜結(jié)合酶或胞內(nèi)酶等釋放出胞外。第二十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。表面活性劑可與細(xì)胞膜中的磷脂及脂蛋白作用而破壞膜結(jié)構(gòu)，增加膜的通透性。例如，TritonX-100（特里頓）是一種非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，其作用主要是破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，從而使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。表面活性劑處理法對(duì)膜結(jié)合酶特別有效。第二十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四在酶的提取方面一般不采用離子型表面活性劑的原因：

離子型表面活性劑會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)破壞，引起酶的變性失活。如何除去表面活性劑？可采用凝膠層析，以免影響下一步分離純化。第二十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

化學(xué)破碎法的優(yōu)點(diǎn)：A、對(duì)產(chǎn)物釋放具有一定選擇性。B、細(xì)胞外形保持完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。第二十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

化學(xué)破碎法的缺點(diǎn)：A、通用性差，某種試劑只能作用于某些特定類型的細(xì)胞。B、時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過50％。C、有些化學(xué)試劑有毒性，在其后的產(chǎn)物提取精制過程中，需設(shè)法分離除去。

第二十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四四、酶促破碎法

通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。第二十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、自溶法（Autolysis）

將發(fā)酵液在一定pH值和適宜溫度條件下保溫一段時(shí)間，由于胞內(nèi)自身酶系破壞細(xì)胞以釋出胞內(nèi)酶的方法。自溶條件：溫度、pH值、離子強(qiáng)度等。自溶時(shí)間一般較長(zhǎng)，不易控制，為防止其他微生物在自溶液中滋長(zhǎng)，必要時(shí)可加入甲苯、氯仿、疊氮鈉等殺菌劑。還可以通過加入噬菌體去感染細(xì)胞，或通過電離輻射等方法，使細(xì)胞自溶。第二十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四自溶法的缺點(diǎn)：易引起所需蛋白質(zhì)的變性；自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速率下降；易引起雜菌或噬菌體感染。第二十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、外加酶處理

根據(jù)細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，選用適當(dāng)?shù)拿福辜?xì)胞壁破壞，并在低滲透壓的溶液中使細(xì)胞破裂。利用外加酶或細(xì)胞本身存在的酶也可使細(xì)胞破碎。第三十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四破壞微生物細(xì)胞壁的酶：溶菌酶、葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等；破壞植物細(xì)胞壁的酶：纖維素酶、半纖維素酶等。第三十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：

選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的不足：

1、溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模應(yīng)用，若回收溶酶則又需要增加分離純化溶酶的操作和設(shè)備，其費(fèi)用也不低；因?yàn)榧尤氲娜芫浮锥≠|(zhì)酶等價(jià)格高，而且外加酶本身混入細(xì)胞破碎液中成為雜質(zhì)，所以只適于實(shí)驗(yàn)室采用。

2、酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶，且不易確定最佳的溶解條件。第三十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理第三十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

破碎細(xì)胞的不同分類方法

第三十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

破碎細(xì)胞的不同分類方法第三十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四破碎細(xì)胞方法：動(dòng)植物細(xì)胞：高速組織搗碎機(jī)組織勻漿器微生物細(xì)胞：機(jī)械破碎法酶法化學(xué)試劑法物理破碎法等多種。第三十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二節(jié)提?。‥xtraction）酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇簶O性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷帷⑾A、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。第三十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第二節(jié)提?。‥xtraction）為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。第三十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對(duì)象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶第三十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、提取的方法1、鹽溶液提取鹽溶現(xiàn)象：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加。原因：鹽濃度較低時(shí)，蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽類離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，使蛋白質(zhì)與水分子間的相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。如：淀粉酶、蛋白酶等胞外酶可用0.14mol/L的氯化鈉溶液提取注：但有少數(shù)酶，如霉菌產(chǎn)生的脂肪酶，用清水提取比鹽溶液提取的效果較好。第四十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第四十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、酸溶液提取有些酶在酸性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用酸溶液提取。如：從胰臟中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可用0.12mol/L的H2SO4。提取時(shí)要注意溶液的pH值不能太低，以免使酶變性失活。胰蛋白酶：pI10.5最適pH7.8-8.5第四十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、堿溶液提取有些酶在堿性條件下溶解度較大，且穩(wěn)定性較好，宜用堿溶液提取。

注意事項(xiàng):操作時(shí)要注意pH值不能過高，以免影響酶的活性。加堿液的過程要一邊攪拌一邊緩慢加進(jìn)，以免出現(xiàn)局部過堿現(xiàn)象，引起酶的變性失活。第四十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四4、有機(jī)溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶難溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿中，常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、丁醇等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。第四十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四其中丁醇對(duì)脂蛋白的解離能力較強(qiáng)，提取效果較好。

原因:丁醇使蛋白質(zhì)的變性較少，親脂性強(qiáng)，易透入細(xì)胞內(nèi)部，與水也能溶解10％，因此具有脂質(zhì)與水之間的表面活性作用，可占據(jù)蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的結(jié)合點(diǎn)，也阻礙蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的再結(jié)合，使蛋白質(zhì)在水中的溶解能力大大增加。第四十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四提示：一些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對(duì)胰島素有極高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸調(diào)溶液的pH為2.5～3.0進(jìn)行提取。第四十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四從下面三個(gè)方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8％的乙醇可以使糜蛋白酶暫時(shí)失活②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca2+；③選用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。還可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的雜蛋白。而對(duì)胰島素的溶解和穩(wěn)定性都沒有影響。第四十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、影響酶提取的主要因素影響因素：溫度、pH、提取液體積等。影響方式：通過影響酶的溶解度及擴(kuò)散速度，進(jìn)而影響酶的提取速度和提取效果。第四十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、影響酶提取的主要因素1、溫度影響溶解度、擴(kuò)散速度過高致酶失活有機(jī)溶劑提取時(shí)，控制在0~10℃第四十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、影響酶提取的主要因素2、pH通過影響酶可解離基團(tuán)的解離狀態(tài)，影響酶溶解度注：避開等電點(diǎn)不宜過高或過低，以免失活第五十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第五十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、影響酶提取的主要因素3、提取液的體積原料體積的3~5倍較好，可提取幾次。4、其他影響因素顆粒體積攪拌提取時(shí)間保護(hù)劑、穩(wěn)定劑（如底物）、抗氧化劑（如Vc）等。第五十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四例：甘薯葉過氧化物酶的提取及分離純化1、粗酶液的提取從莖尖起，摘取甘薯莖上第8至第14片葉，用蒸餾水洗凈，擦干，稱質(zhì)量。按1：4（m/V）加入0.05mol/LpH7.2預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，搗碎，置4℃冰箱中抽提4h。在4℃下10000r/min離心兩次，每次30min，收集上清液，即得粗酶液。第五十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

第三節(jié)沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使溶液中某些溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，達(dá)到與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。凡是能破壞蛋白質(zhì)分子水化作用或減弱分子間同性相斥作用的因子，都有可能降低蛋白質(zhì)在水中的溶解度而使它沉淀下來(lái)。第五十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四根據(jù)酶提取時(shí)所采用的溶劑或溶液的不同，沉淀分離法可分為：

鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法等電點(diǎn)沉淀法選擇性變性沉淀法復(fù)合沉淀法等

第五十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

沉淀分離方法沉淀分離法分離原理鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離第五十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四沉淀分離法分離原理復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來(lái)，從而使酶與雜質(zhì)分離選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不斷影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離

沉淀分離方法第五十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

一、鹽析沉淀法定義：利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離的過程?；驹恚褐行喳}的親水性大于酶分子的親水性，加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域；同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。第五十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四鹽析與鹽溶鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象稱為鹽溶。鹽析：在鹽濃度升高到一定濃度后，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白質(zhì)沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。第五十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第六十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四蛋白質(zhì)和酶在溶液中的溶解度與溶液中的離子強(qiáng)度有密切關(guān)系：

logS=logS0

－KsI

式中S——蛋白質(zhì)或酶在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度（g/L）

S0——酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)（即在純?nèi)軇┲?，無(wú)鹽溶液中）的溶解度（g/L）

I——離子強(qiáng)度

Ks——鹽析系數(shù)Ks為鹽析系數(shù)，它與溶質(zhì)的結(jié)構(gòu)，鹽的價(jià)數(shù)有關(guān)。logS0是一個(gè)常數(shù)，如果用β表示它，鹽析方程可寫為：

logS

＝β－KsI

Ks

：鹽析系數(shù)代表鹽析效率，決定于鹽的性質(zhì)，與酶結(jié)構(gòu)有關(guān)；大小與離子價(jià)數(shù)成正比，與離子半徑和溶液的介電常數(shù)成反比。

β:主要決定于酶或蛋白的性質(zhì)，在溫度和pH值一定時(shí)，是常數(shù)。第六十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

與離子濃度mi、離子價(jià)數(shù)Zi有關(guān)。

I＝1/2∑miZi2

離子強(qiáng)度I？

計(jì)算0.2mol/L(NH4)2SO4的離子強(qiáng)度？第六十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四定義：由于不同的蛋白質(zhì)其溶解度與等電點(diǎn)不同，沉淀時(shí)所需的pH值與離子強(qiáng)度也不相同，改變鹽的濃度與溶液的pH值，可將混合液中的蛋白質(zhì)分批鹽析分開。Ks分段鹽析：在一定的溫度和pH值條件下（β為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法；β分段鹽析：在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法。

分段鹽析(fractionalsaltingout)第六十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四常用的鹽析劑:硫酸銨優(yōu)點(diǎn)：鹽析能力強(qiáng)在水中溶解度最大（25℃時(shí)為4.1mol/L）而溫度系數(shù)最?。▽?duì)溫度不敏感）價(jià)格便宜濃度高時(shí)也不會(huì)引起蛋白質(zhì)和酶生物活性的喪失，抽提效果好。缺點(diǎn)：緩沖能力差，NH4＋的存在干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定，得到的樣品欲繼續(xù)純化時(shí)，需花一定時(shí)間脫鹽。

第六十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四方法：固體硫酸銨加入之前要先將其研成細(xì)粉不能有塊，要在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，尤其到接近計(jì)劃飽和度時(shí)，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應(yīng)有的蛋白質(zhì)沉淀。鹽析后要在冰浴中放置一段時(shí)間，待沉淀完全后再離心與過濾。在低濃度硫酸銨中鹽析可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來(lái)需要較高的離心速度和較長(zhǎng)的離心時(shí)間。

第六十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四注意：

鹽析時(shí)pH值應(yīng)調(diào)節(jié)至待沉淀的酶蛋白的等電點(diǎn)附近，因?yàn)檫_(dá)到等電點(diǎn)pH時(shí)，蛋白質(zhì)的的溶解度最小。硫酸銨濃度的表示方法：是以飽和溶液的百分?jǐn)?shù)表示，稱為百分飽和度，而不用實(shí)際的克數(shù)或克分子數(shù)。飽和度：指溶液中加入的飽和硫酸銨的體積與混合溶液總體積之比值。如：70ml酶液加入30ml飽和硫酸銨溶液，則混合溶液中硫酸銨的飽和度為30/(30+70)=0.3第六十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第六十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第六十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第六十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

鹽析曲線的制作用鹽析法沉淀欲分離樣品時(shí)，所需濃度范圍要通過試驗(yàn)確定。

步驟：抽提液（調(diào)好pH值）離心得上清液……得到6-10個(gè)分級(jí)沉淀部分。第七十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四硫酸銨分級(jí)沉淀試驗(yàn)舉例批次百分飽和酶沉淀/%pr.沉淀/%純化倍數(shù)度范圍/%(得率）第一次0～40425

40～6062 22 2.860～8032 32 1.0第二次 0～45 6 3245～709038 2.4第三次0～481035

48～65 75 25 3.0

第七十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四酶在40%～60%鹽中沉淀比在60%～80%的多；要改試45%～70%。45%～70%鹽中收得率高，但純度降低，要改試48%～65%。從上表分析：若生物材料來(lái)源容易，主要考慮純化倍數(shù)，選擇48%～65%。材料來(lái)源困難，則要考慮收得率，則選擇45%～70%。第七十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第七十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、等電點(diǎn)沉淀法定義：利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH值，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。第七十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第七十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、有機(jī)溶劑沉淀法

基本原理：（1）有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。（2）由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。第七十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。②沉淀有機(jī)溶劑可回收、易除去，得到的沉淀易于離心分離或過濾，過濾比較容易（也可用透析袋脫有機(jī)溶劑），在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。③不含無(wú)機(jī)鹽，不用脫鹽。適用于食品工業(yè)中酶制劑的制備。有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)：第七十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。沉淀析出后要盡快分離，盡量減少有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響。缺點(diǎn)：第七十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四注意事項(xiàng)：①有機(jī)溶劑沉淀全過程必須在低溫下操作，一般在0℃左右。因?yàn)闇囟仍降停恋硪嘣酵耆?。所用有機(jī)溶劑也要預(yù)冷，所得沉淀要盡快低溫離心并立即用冷緩沖液溶解以降低有機(jī)溶劑濃度。

pH值調(diào)至待分離酶的等電點(diǎn)附近有助于沉淀效果。第七十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四②加入適量中性鹽能增加pr.在有機(jī)溶劑中的溶解度，降低有機(jī)溶劑對(duì)pr.的變性作用，提高分級(jí)效果。但是過量加入，可引起pr.析出，影響有機(jī)溶劑的分級(jí)作用。所以有機(jī)溶劑沉淀pr.時(shí)，宜在稀鹽溶液或低濃度緩沖液中進(jìn)行。第八十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四大致可認(rèn)為沉淀的能力是：丙酮>乙醇>甲醇。丙酮沉淀能力最好，但揮發(fā)損失多，價(jià)格較貴，所以工業(yè)上通常采用乙醇作為沉淀劑。第八十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第八十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四四、復(fù)合沉淀法（有機(jī)聚合物沉淀法）在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶及其他相關(guān)蛋白形成復(fù)合物沉淀，再用適當(dāng)方法使待分離酶溶解出來(lái)（選擇性抽提），從而除去雜蛋白、除去沉淀劑，達(dá)到分離純化目的。酶（蛋白質(zhì)）沉淀劑（或稱復(fù)合沉淀劑）：能與酶形成復(fù)合物沉淀的物質(zhì)。如：聚丙烯酸、聚乙二醇、單寧等。第八十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四如：聚丙烯酸可沉淀帶正電蛋白質(zhì)。聚丙烯酸分子上有相當(dāng)多的羧基，堿性蛋白質(zhì)含較多的堿性基團(tuán)，羧基和堿性基團(tuán)形成鹽鍵，則把聚丙烯酸和堿性蛋白質(zhì)結(jié)合而形成很大顆粒沉淀下來(lái)。堿性蛋白質(zhì)沉淀與溶液分開，在沉淀中加入鈣離子后，聚丙烯酸成鈣鹽，蛋白質(zhì)則游離出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)純化。

PAA（聚丙烯酸）＋E——PAA-E↓PAA-E+Ca2＋

——PAA-Ca↓＋EPAA-Ca＋H2SO4——PAA+CaSO4↓第八十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

五、選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需酶的分離方法。

⑴熱變性

利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀。此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。

第八十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四⑵表面活性劑和有機(jī)溶劑變性

不同蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于表面活性劑和有機(jī)溶劑的敏感性不同，在分離純化過程中使用它們可以使那些敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。通常都在冰浴或冷室中進(jìn)行，以保護(hù)目的物的生物活性。

第八十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四⑶選擇性酸堿變性

利用蛋白質(zhì)和酶等對(duì)于溶液中酸堿的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個(gè)分離純化步驟。

第八十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第四節(jié)離心分離離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。運(yùn)用：在酶的提取和分離過程中，細(xì)胞的收集、細(xì)胞碎片和沉淀的分離以及酶的純化等。第八十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、離心機(jī)的選擇分類：（1）按離心機(jī)轉(zhuǎn)速的不同可分為：常速（低速）、高速和超速3種（2）按用途分：工業(yè)或?qū)嶒?yàn)型，分析或制備型（有分析用、制備用及分析－制備兩用）（3）按使用溫度分：常溫或冷凍（4）按分離形式可分為：沉降法和過濾法兩大類（5）按操作方式有間歇、連續(xù)和半連續(xù)之分（6）按結(jié)構(gòu)特點(diǎn)則有管式、吊籃式、轉(zhuǎn)鼓式和碟式等多種。第八十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、常速離心機(jī)常速離心機(jī)又稱低速離心機(jī)。最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力(RCF)在1×104g以下。

在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)上廣泛應(yīng)用。主要用于分離細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝?，也用于粗結(jié)晶等較大顆粒的分離。第九十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

2、高速離心機(jī)轉(zhuǎn)速?gòu)?×104～2.5×104r/min，相對(duì)離心力達(dá)1×104～105g。主要用于分離各種沉淀物、細(xì)胞碎片和較大的細(xì)胞器等。高速冷凍離心機(jī)：為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)了冷凍裝置。第九十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

3、超速離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速達(dá)2.5×104～8×104r/min，最大離心力達(dá)5×105g。精密度相當(dāng)高。為了防止樣品液濺出，一般附有離心管帽；為了防止溫度升高，均有冷凍裝置和溫度控制系統(tǒng)；為了減少空氣阻力和摩擦，設(shè)置有真空系統(tǒng)；還有一系列安全保護(hù)系統(tǒng)、制動(dòng)系統(tǒng)及各種指示儀表等。第九十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四按其用途有：制備用超速離心機(jī)、分析用超速離心機(jī)以及分析制備兩用離心機(jī)3種。制備用超速離心機(jī)：主要用于生物大分子、細(xì)胞器和病毒等的分離純化。分析用超速離心機(jī)：可用于樣品純度的檢測(cè)、沉降系數(shù)和分子量的測(cè)定。一般都裝有光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)、自動(dòng)記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等。第九十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第九十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、離心方法的選用對(duì)于常速離心機(jī)和高速離心機(jī)，由于所分離的顆粒的大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時(shí)間，就能達(dá)到分離效果，若樣品中存在兩種以上大小和密度不同的顆粒，則采用差速離心。在超速離心中，離心方法可分為差速離心、密度梯度離心和等密度梯度離心等。

第九十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、差速離心

采用不同的離心速度和離心時(shí)間，逐漸增加離心速率或低速與高速交替進(jìn)行離心，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法，稱為差速離心。用途：用于分離那些大小與密度相差較大的顆粒。根據(jù)沉降系數(shù)不同得以分離。第九十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四優(yōu)點(diǎn)：

操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子。缺點(diǎn)：

（1）分離效果差，不能一次得到純顆粒。（2）壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別是當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀。（3）顆粒被擠壓，離心力過大，離心時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形，聚集而失活。第九十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第九十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第九十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、密度梯度離心（速度區(qū)帶離心）

是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。將樣品置于一個(gè)平緩的介質(zhì)梯度中沉降。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠(yuǎn)處（X2）介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。第一百零一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四密度梯度系統(tǒng)是在溶劑中加入一定的溶質(zhì)制成，這種溶質(zhì)稱為梯度介質(zhì)。梯度介質(zhì)應(yīng)有足夠大的溶解度，以形成所需的密度，不與分離組分反應(yīng)，而且不會(huì)引起分離組分的凝集、變性或失活（即惰性梯度介質(zhì)）。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統(tǒng)。其梯度范圍是：蔗糖濃度5～60％，密度1.02～1.30g/cm3。第一百零二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四密度梯度的制備：采用密度梯度混合器。密度梯度可分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。密度梯度離心常用的是：線性梯度。配制時(shí)將稀液置于貯存室B，濃液置于混合室A，兩室的液面必需在同一水平上。第一百零三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

開動(dòng)攪拌器后，同時(shí)打開閥門a和b，流出的梯度液經(jīng)過導(dǎo)液管小心地收集在離心管中。也可把稀液置于A室，把濃液置于B室，但此時(shí)梯度液的導(dǎo)液管必須直插到離心管底，讓后來(lái)流入的濃溶液將先流入的稀溶液頂浮起來(lái)，形成由管口到管底逐步升高的密度梯度。a,b-閥門第一百零四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

優(yōu)點(diǎn)：一次離心就能同時(shí)純化不同大小的顆粒，而不必分開進(jìn)行。注意事項(xiàng)：離心時(shí)間要嚴(yán)格控制，既有足夠的時(shí)間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達(dá)到沉淀前。如果離心時(shí)間過長(zhǎng)，所有的樣品可全部到達(dá)離心管底部；離心時(shí)間不足，樣品還沒有分離。此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。第一百零五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四密度梯度離心過程中，區(qū)帶的位置和寬度隨離心時(shí)間的不同而改變。離心時(shí)間越長(zhǎng)，由于顆粒擴(kuò)散而使區(qū)帶越來(lái)越寬。適當(dāng)增大離心力而縮短離心時(shí)間，可以減少由于擴(kuò)散而導(dǎo)致的區(qū)帶擴(kuò)寬等現(xiàn)象。第一百零六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四A：等速度沉降第一百零七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、等密度梯度離心（平衡等密度離心）當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力作用下，不同浮力密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移動(dòng)到與它們各自浮力密度恰好相等的位置（等密度點(diǎn)），形成區(qū)帶。適用于分離大小相近而密度不同的樣品.第一百零八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四B：等密度沉降

第一百零九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四等密度梯度離心常用的銫鹽，如氯化銫（CsCl）、硫酸銫（Cs2SO4）等。離心操作時(shí)，先把一定濃度的介質(zhì)溶液與樣品液混合物均勻，也可將一定重量的結(jié)晶銫鹽加到一定量的樣品液中使之溶解。然后在選用的離心力作用下，經(jīng)過足夠時(shí)間的離心分離，銫鹽在離心場(chǎng)中沉降，自動(dòng)形成密度梯度。第一百一十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四等密度離心的特點(diǎn)：

（1）離心過程很長(zhǎng)；（2）不需粘性介質(zhì)；（3）顆粒的最終分布與其大小和質(zhì)量無(wú)關(guān)，只受其浮力密度影響；（4）樣品可以和整個(gè)梯度相混合；（5）樣品裝載容積比密度梯度離心大。第一百一十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百一十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四三、離心條件的確定

1、離心力離心分離是借助于離心機(jī)產(chǎn)生的離心力。離心力的數(shù)據(jù)是指其平均值，即在離心溶液中點(diǎn)顆粒所受離心力。第一百一十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四Fc=macm：顆粒質(zhì)量，ac離心加速度

ω：轉(zhuǎn)子角速度（rad/s）;r=旋轉(zhuǎn)半徑

n:轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)高速離心需用：相對(duì)離心力（RCF）離心力：第一百一十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四相對(duì)離心力：指顆粒所受的離心力與地心引力（重力）之比。RCF=Fc/Fg=mac/mg=g:重力加速度；Fg：地心引力（重力）如：超速離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為60000r/min（即1000r/s），轉(zhuǎn)軸中心至離心管中心的距離為6cm。則：RCF為：

2.4×105g，比重力大24萬(wàn)倍。

第一百一十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。第一百一十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四三者關(guān)系列線圖第一百一十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

2、離心時(shí)間：依據(jù)離心方法的不同概念有所差別對(duì)于差速離心來(lái)說，是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時(shí)間；對(duì)等密度梯度離心而言,是指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間；對(duì)密度梯度離心所需的時(shí)間則是指形成界限分明的區(qū)帶的時(shí)間。沉降時(shí)間決定于顆粒沉降速度和沉降距離。第一百一十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四沉降時(shí)間：顆粒沉降時(shí)間：指顆粒從離心樣品液面完全沉降到離心管底所需時(shí)間。決定因素：顆粒沉降速度、沉降距離t：沉降時(shí)間（s）S：顆粒沉降系數(shù)（s）ω：轉(zhuǎn)子角速度（rad/s）

r1：樣品液面旋轉(zhuǎn)軸中心；

r2：離心管底旋轉(zhuǎn)軸中心第一百一十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四轉(zhuǎn)子效率因子K，K系數(shù)是用來(lái)描述在一個(gè)轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來(lái)的效率。

生產(chǎn)廠家已在轉(zhuǎn)子出廠時(shí)標(biāo)出最大轉(zhuǎn)速時(shí)的K值，可根據(jù)：

算出其它轉(zhuǎn)速的K值。原則上，K系數(shù)愈小的，愈容易、愈快將粒子沉降。

整理為：

＝1/S第一百二十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四當(dāng)S、r1、r2確定后，ω2t是一常數(shù)，即在離心機(jī)及轉(zhuǎn)子定下后，r1、r2不變，對(duì)某種物質(zhì)顆粒S也是確定的，對(duì)顆粒沉降起決定作用的是轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)速ω和沉降時(shí)間t。

例1：在離心機(jī)及轉(zhuǎn)子定下后，10000r/min離心10min，計(jì)算若用5000r/min需離心的時(shí)間：？40min第一百二十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四對(duì)不知其沉降系數(shù)的球形顆粒，可根據(jù)下式估算沉降時(shí)間：T：沉降時(shí)間(S)；μ：介質(zhì)溶液的粘度(P)；ρ、ρ0分別為顆粒和介質(zhì)溶液的密度(g/cm);d：顆粒平均直徑(cm);r2、r1：旋轉(zhuǎn)軸中心到離心管底和液面的距離(cm)第一百二十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、溫度和pH值離心溫度一般控制在4℃左右，對(duì)于某些熱穩(wěn)定性較好的酶等，離心也可在室溫下進(jìn)行。但在超速離心和高速離心時(shí)，轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會(huì)發(fā)熱，從而引起溫度升高。故必須采用冷凍系統(tǒng)。離心介質(zhì)溶液的pH值應(yīng)該是處于酶穩(wěn)定的pH范圍，必要時(shí)可采用緩沖液。過酸或過堿還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)的其它部件的腐蝕，應(yīng)盡量避免。

第一百二十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四例：甘薯葉過氧化物酶的提取及分離純化2.硫酸銨分級(jí)沉淀往粗酶液中邊攪拌邊加入研磨后的硫酸銨至20%飽和度，25℃下鹽析2h，離心除雜蛋白；再加硫酸銨至80%飽和度，25℃下鹽析2h，離心，收集沉淀；加入提取緩沖液至沉淀充分溶解為止；將溶液進(jìn)行超濾脫鹽，得到初步純化的POD酶液。第一百二十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

第六節(jié)過濾和膜分離過濾：借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。過濾介質(zhì)：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等。分類：膜過濾（膜分離技術(shù)）與非膜過濾第一百二十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

一、非膜過濾采用高分子膜以外的材料，如：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)。包括粗濾和微濾。第一百二十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

（一）粗濾粗濾：借助于過濾介質(zhì)截留懸浮液中直徑大于2μm的大顆粒，而使固液分離的技術(shù)。助濾劑：為了加快過濾速度，提高分離效果。如：硅藻土、活性炭等。根據(jù)推動(dòng)力產(chǎn)生的條件不同，過濾可分為常壓過濾、加壓過濾和減壓過濾。

第一百二十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、常壓過濾以液位差為推動(dòng)力。過濾裝置豎直安裝，懸浮液置于過濾介質(zhì)的上方，由于存在液位差，在重力的作用下，濾出液通過過濾介質(zhì)流向下方，大顆粒物質(zhì)被截留在介質(zhì)表面。優(yōu)點(diǎn)：常壓過濾設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便易行。缺點(diǎn)：過濾速度較慢，分離效果較差，難以大規(guī)模連續(xù)使用。第一百二十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四吊袋離心機(jī)第一百二十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、加壓過濾以壓力泵或壓縮空氣為過濾的推動(dòng)力。在生產(chǎn)中常用的各種壓濾機(jī)；還可采用添加助濾劑，降低懸浮液粘度和適當(dāng)提高溫度等措施。特點(diǎn)：設(shè)備比較簡(jiǎn)單，過濾速度較快，效果較好，在生產(chǎn)中廣泛使用。第一百三十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四壓濾機(jī)第一百三十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、減壓過濾又稱真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質(zhì)的下方抽真空的方法，增加過濾介質(zhì)上下方之間的壓差，推動(dòng)液體通過過濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過濾方法。需要配備有抽真空系統(tǒng)，而且壓力差最高不超過0.1Mpa，故多用于粘性不大的物料的過濾分離。

第一百三十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四真空抽濾機(jī)第一百三十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

（二）微濾截留物質(zhì)顆粒直徑為0.2～2μm。主要用于分離細(xì)菌、灰塵等光學(xué)顯微鏡可看到的物質(zhì)顆粒。在無(wú)菌水、軟飲料、礦泉水等的生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用。第一百三十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

二、膜分離技術(shù)借助于一定孔徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿臃蛛x的技術(shù)。選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。根據(jù)物質(zhì)顆粒或分子通過薄膜的原理和推動(dòng)力的不同，膜分離分為3大類：

加壓膜分離、電場(chǎng)膜分離、擴(kuò)散膜分離第一百三十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、加壓膜分離以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)。在靜壓差的作用下，小于孔徑的物質(zhì)顆粒穿過膜孔，而大于孔徑的顆粒被截留。根據(jù)所截留的顆粒大小的不同，加壓膜分離可分為微濾、超濾和反滲透。第一百三十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（1）微濾：

是以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。截留物質(zhì)顆粒直徑為0.2～2μm。主要用于分離細(xì)菌、灰塵等光學(xué)顯微鏡可看到的物質(zhì)顆粒。在無(wú)菌水、軟飲料、礦泉水等的生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用。

第一百三十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四微濾膜第一百三十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（2）超濾是借助于超濾膜將不同分子量的物質(zhì)分離的技術(shù)。截留的顆粒直徑從20～2000?（0.002～0.2μm），相當(dāng)于分子量1000～5×105Da。主要用于分離病毒和各種生物大分子。第一百三十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超濾膜第一百四十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超濾膜剖面及工作原理第一百四十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超濾膜凈水原理流程圖第一百四十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四杯式超濾器（內(nèi)置懸掛攪拌子）第一百四十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四超濾過程中，小分子物質(zhì)與溶劑（一般是水）分子一同透過膜孔滲出。不同孔徑的膜有不同的透過性。膜的透過性一般以流率表示。流率是指每平方厘米的膜每分鐘透過的流體的量，以mL/(cm2·min)表示。第一百四十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四影響超濾流率的因素：①主要因素是膜孔徑的大?。虎谌芤褐蓄w粒的形狀與大小不同，其超濾流率也不同，一般說來(lái)，相對(duì)密度小的分子透過性較好，球狀分子比相同分子量的纖維狀分子透過性好，小分子比大分子的透過性好；③溶液濃度越高，超濾流率越??；第一百四十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四④操作壓力對(duì)超濾流率的影響比較復(fù)雜。

一般情況下，壓力增加時(shí)，超濾的流率增加，但對(duì)于一些膠體溶液，當(dāng)壓力高到一定程度后，再增加壓力，超濾流率不再增加；對(duì)于一般溶質(zhì)分子而言，壓力增加時(shí)，其透過性降低。但某些溶質(zhì)分子可隨著壓力增加而提高其透過性。超濾時(shí)的操作壓力一般控制在50～700KPa。⑤適當(dāng)提高溫度，增加攪拌速度等都有利于提高超濾流率。但溫度和攪拌速度不能過高，以免引起酶和其它活性大分子變性失活。第一百四十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（3）反滲透在滲透實(shí)驗(yàn)裝置的膜兩側(cè)造成一個(gè)壓力差，并使其大于滲透壓，就會(huì)發(fā)生溶劑倒流，使得濃度較高的溶液進(jìn)一步濃縮。反滲透孔徑小于20?，被截留物質(zhì)分子量小于1000Da，操作壓力為0.7-13MPa。主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)。

第一百四十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四滲透：是一種物理現(xiàn)象，當(dāng)兩種含有不同鹽類濃度的溶液用一張半透膜隔開時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)，含鹽量少的一邊的溶劑會(huì)自發(fā)地向含鹽量高的一側(cè)流動(dòng)的過程。滲透壓：滲透直到兩側(cè)的液位差（即壓力差）達(dá)到一個(gè)定值時(shí)，滲透停止，此時(shí)的壓力差即為滲透壓。滲透壓只與溶液的種類、鹽濃度和溫度有關(guān)，而與半透膜無(wú)關(guān)。第一百四十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百四十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

過濾的分類及其特性

類別截留的顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜第一百五十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四2、電場(chǎng)膜分離

電場(chǎng)膜分離是在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。在電場(chǎng)作用下，小分子的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)，透過半透膜，而達(dá)到分離的目的。第一百五十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（1）電滲析用兩塊半透膜將滲析槽分隔成3個(gè)室，兩塊膜之間的中心室通入待分離的溶液，在兩側(cè)的室中裝入水或緩沖液，并分別裝上正、負(fù)電極。接通直流電源后，中心室溶液中的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，透過半透膜到達(dá)陰極槽，而陰離子則移向陽(yáng)極槽，從而達(dá)到分離。電滲析主要用于酶液或其它溶液的脫鹽、海水淡化、純水制備及其他帶電荷的小分子的分離。第一百五十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

（2）離子交換膜電滲析以離子交換膜代替一般的半透膜。在電場(chǎng)中交替裝配的陰離子和陽(yáng)離子交換膜，在電場(chǎng)中形成一個(gè)個(gè)隔室，使溶液中的離子有選擇地分離或富集，這就是離子交換電滲析。離子交換膜的選擇透過性比一般半透膜強(qiáng)，（1）由于膜的孔徑大小不同，只讓小于孔徑的顆粒透過，而把大于孔徑的物質(zhì)截留；（2）由于膜上帶有某種基團(tuán)，根據(jù)同性電荷相斥，異性電荷相吸的原理，只讓帶異性電荷的顆粒透過，而把同性電荷的物質(zhì)截留。第一百五十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

在直流電場(chǎng)的作用下，由于離子交換的阻隔作用，實(shí)現(xiàn)溶液的淡化和濃縮，分離推動(dòng)力是靜電引力。第一百五十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

電滲析器：利用離子交換膜的選擇透過性進(jìn)行工作，主要組成部分是離子交換膜。分為陽(yáng)膜、陰膜。陽(yáng)膜只允許陽(yáng)離子通過而陰離子被阻擋；陰膜只允許陰離子通過而陽(yáng)離子被阻擋。

第一百五十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四3、擴(kuò)散膜分離利用小分子物質(zhì)的擴(kuò)散作用，不斷透過半透膜擴(kuò)散到膜外，而大分子被截留，從而達(dá)到分離的效果（透析）。膜材：動(dòng)物膜、羊皮紙、火棉膠等制成常見：透析袋、透析管、透析槽主要用途：用于酶等生物大分子的分離純化，從中除去無(wú)機(jī)鹽等小分子物質(zhì)。第一百五十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四透析袋第一百五十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百五十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百五十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百六十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第一百六十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四例：甘薯葉過氧化物酶的提取及分離純化2.硫酸銨分級(jí)沉淀往粗酶液中邊攪拌邊加入研磨后的硫酸銨至20%飽和度，25℃下鹽析2h，離心除雜蛋白；再加硫酸銨至80%飽和度，25℃下鹽析2h，離心，收集沉淀；加入提取緩沖液至沉淀充分溶解為止；將溶液進(jìn)行超濾脫鹽，得到初步純化的POD酶液。第一百六十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四第六節(jié)層析分離（chromatography）

層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。第一百六十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四層析分離方法

層析方法分離原理吸附層析利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離第一百六十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四上海滬西MC99-2自動(dòng)液相色譜分離層析儀組合式含：核酸蛋白檢測(cè)儀；恒流泵；自動(dòng)部份收集器；梯度混合器。

系統(tǒng)配置：XWT-S臺(tái)式記錄儀1臺(tái)；

層析柱：Φ1.0×40，Φ1.6×50，Φ2.5×60各一支波

長(zhǎng)：254，280nm；

定時(shí)范圍：1秒-100分流

量：1-80ml/m；

收集容量：12ml×100給出梯度：1000ml，梯度形狀可直線第一百六十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四AKTATMprime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)專為實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的蛋白質(zhì)簡(jiǎn)易純化而設(shè)計(jì)的采用簡(jiǎn)易模板編程，操作容易自動(dòng)系統(tǒng)清洗，緩沖液和樣品選擇自動(dòng)上樣在線紫外電導(dǎo)檢測(cè)自動(dòng)峰檢測(cè)和收集．

第一百六十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

蛋白純化系統(tǒng)

型號(hào)：AKTApurifierUPC10

AKTApurifier是一個(gè)快速分離肽、核酸、蛋白和天然產(chǎn)物的全新液相色譜系統(tǒng)，其配套的色譜柱和方法模板可以進(jìn)行凝膠過濾、離子交換、疏水層析、反向?qū)游龊陀H和層析，適合從一般科研檢驗(yàn)到藥品質(zhì)檢或臨床分析應(yīng)用。本臺(tái)儀器還配有組份收集器Fra-920，具有峰收集功能，可使用UNICORN軟件控制。AKTApurifier快速純化系統(tǒng)是GE醫(yī)療集團(tuán)的AmershamBiosciences公司產(chǎn)品，可以操作各種層析技術(shù)，適合分離和純化各種生物分子，包括天然蛋白質(zhì)，重組和融合蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、質(zhì)粒、病毒、抗生素、生物堿等等，適合操作肽圖等精確分析和小量制備應(yīng)用，最適于純化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。第一百六十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四一、吸附層析（AdsorptionChromatography）1、原理吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同，而使混合液中的各組分分離的方法。吸附是物理過程，即物理吸附，又稱范德華力吸附，主要是分子間相互作用的范德華力所引起的，指某些物質(zhì)能夠從溶液中將溶質(zhì)濃集在其表面的現(xiàn)象。第一百六十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

吸附與解吸附、吸附平衡：吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來(lái)。在單位時(shí)間內(nèi)被吸附于吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時(shí)間內(nèi)離開此表面的分子之間可以建立動(dòng)態(tài)平衡。吸附層析過程就是不斷地產(chǎn)生平衡和不平衡、吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡過程。第一百六十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四用于酶的分離純化的吸附劑：有硅藻土、氧化鋁、磷酸鈣和活性炭等。這些吸附劑一般在低pH值、低離子強(qiáng)度的條件下對(duì)酶有較強(qiáng)的吸附作用，而在提高pH值和增加離子強(qiáng)度的條件下，酶可解吸洗脫出來(lái)。吸附劑可裝在吸附柱上進(jìn)行吸附柱層析，也可把吸附劑加到酶液中，吸附后過濾出來(lái)，再加進(jìn)洗脫劑，使酶解吸而洗脫出來(lái)。第一百七十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（1）溶劑洗脫法（2）置換洗脫法（3）前緣洗脫法2、洗脫方法第一百七十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

（1）溶劑洗脫法是采用單一或者混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法。是運(yùn)用最廣泛的一種方法。操作時(shí)，最初的流出液為溶劑本身，接著是吸附力較弱的組分，吸附力最強(qiáng)的組分最后洗脫出來(lái)?！巴衔病爆F(xiàn)象：洗脫峰兩側(cè)不對(duì)稱，峰前側(cè)陡峭，峰后側(cè)較平緩。解決辦法：采用梯度洗脫法（pH梯度洗脫液、濃度洗脫液）第一百七十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四溶劑洗脫法的洗脫曲線洗脫液體積物質(zhì)濃度第一百七十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

(2)置換洗脫法置換洗脫液中含有一種吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的稱為置換劑的物質(zhì)。置換劑取代原來(lái)被吸附組分的位置，使被吸附組分不斷向下移動(dòng)。樣品中的各組分按照吸附力從弱到強(qiáng)順序先后流出。不足：各組分界限不分明，分離效果不理想。第一百七十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四置換洗脫法洗脫曲線洗脫液體積物質(zhì)濃度AB第一百七十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

（3）前緣洗脫法

（前緣分析法）所用的洗脫液為含有各組分的混合液本身，最初流出的是混合液中的溶劑，不含有分離的組分。吸附力最弱的組分開始流出，其濃度比混合液中該組分的濃度高。按照吸附力由弱到強(qiáng)的順序，先后以兩組分、三組分······多組分的混合液流出最后流出液與欲分離混合液的組分完全相同。不是理想的研究方法，僅作為前緣組分的分析研究之用。第一百七十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四前緣洗脫法洗脫曲線洗脫液體積物質(zhì)濃度AA+BA+B+C只有A組分與其他組分分離第一百七十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

3、吸附劑與洗脫劑的選擇（1）吸附劑的選擇極性物質(zhì)容易被極性表面吸附；非極性物質(zhì)容易被非極性表面吸附；溶液中溶解度越大的物質(zhì)越難被吸附。用于酶的分離純化的吸附劑一般在較低pH值、低離子強(qiáng)度的條件下對(duì)酶有較強(qiáng)的吸附作用，而在提高pH值和增加離子強(qiáng)度的條件下，酶可被解吸而洗脫下來(lái)。第一百七十八頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四吸附劑種類：有機(jī)吸附劑、無(wú)機(jī)吸附劑化學(xué)性質(zhì)不活潑的多孔材料，比表面積大如：硅膠、磷酸鈣、氧化鋁、硅藻土、泡沸石、陶土等。第一百七十九頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四（2）洗脫劑的選擇

注意點(diǎn)：（1）洗脫劑不會(huì)與吸附劑起化學(xué)反應(yīng)，也不會(huì)使吸附劑溶解；（2）洗脫劑對(duì)混合液中的各組分的溶解度大，粘度小，流動(dòng)性好，容易與被洗脫的組分分離；（3）洗脫劑要求一定的純度，以免雜質(zhì)對(duì)分離帶來(lái)不利影響。第一百八十頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法吸附層析（AdsorptionChromatography）第一百八十一頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四二、分配層析

（DistributionChromatography）

概念：是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的層析技術(shù)，相當(dāng)于一種連續(xù)性的溶劑抽提方法。固定相：極性溶劑（例如水、稀硫酸、甲醇等），能和多孔的支持物(常用的是吸附力小、反應(yīng)性弱的惰性物質(zhì)如淀粉、纖維素粉、濾紙等)緊密結(jié)合，使呈不流動(dòng)狀態(tài)；

流動(dòng)相：非極性的有機(jī)溶劑。

第一百八十二頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

在層析過程中，當(dāng)有機(jī)溶劑流動(dòng)相流經(jīng)樣品點(diǎn)時(shí)，樣品中的溶質(zhì)便按其分配系數(shù)部分地轉(zhuǎn)入流動(dòng)相向前移動(dòng)。當(dāng)經(jīng)過前方固定相時(shí)，流動(dòng)相中的溶質(zhì)就會(huì)進(jìn)行分配，一部分進(jìn)入固定相。通過這樣不斷進(jìn)行的流動(dòng)和再分配，溶質(zhì)沿著流動(dòng)方向不斷前進(jìn)。

第一百八十三頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四分配系數(shù)(K)：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩相溶劑中的濃度的比值。分配系數(shù)（K）=物質(zhì)在固定相中的濃度物質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度K值大表示該組分在固定相結(jié)合力大，則Rf小。不同物質(zhì)（組分）的Rf和K是不一樣的，其差異程度決定其分離效果，差異越大，分離效果越好。第一百八十四頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四

各種溶質(zhì)由于分配系數(shù)不同，向前移動(dòng)的速度也各不相同。分配系數(shù)較大的物質(zhì)，由于分配在固定相多些，分配在流動(dòng)相少些，溶質(zhì)移動(dòng)較慢；而分配系數(shù)較小的物質(zhì)，流動(dòng)速度較快。從而將分配系數(shù)不同的物質(zhì)分離開來(lái)。第一百八十五頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四1、紙上層析第一百八十六頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四葉片中色素的分離——紙層析第一百八十七頁(yè)，共二百八十四頁(yè)，編輯于2023年，星期四涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質(zhì)為固定相，以液體為流動(dòng)相的一種層析方法。分辨率