實(shí)驗(yàn)三雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)三雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定第1頁(yè)/共16頁(yè)蛋白質(zhì)含量測(cè)定

雙縮脲法（Biuret法）

第2頁(yè)/共16頁(yè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)分光光度法測(cè)定的原理和方法學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)含量測(cè)定的原理和方法掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法第3頁(yè)/共16頁(yè)實(shí)驗(yàn)原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。

紫色絡(luò)合物第4頁(yè)/共16頁(yè)

紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍為1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測(cè)定。第5頁(yè)/共16頁(yè)蛋白質(zhì)測(cè)定方法:雙縮脲法（biuret法）微量凱氏（kjeldahl）定氮法folin—酚試劑法考馬斯亮蘭法紫外吸收法總蛋白定量分析－BCA第6頁(yè)/共16頁(yè)實(shí)驗(yàn)試劑與器材

（一）、實(shí)驗(yàn)試劑

1、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（BSA）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NNaOH配制。2、雙縮脲試劑第7頁(yè)/共16頁(yè)（二）、實(shí)驗(yàn)器材可見(jiàn)光分光光度計(jì)

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分光光度計(jì)的基本原理是溶液中的物質(zhì)在光的照射下，產(chǎn)生了對(duì)光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過(guò)溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合比色原理——Lambert-Beer'slaw:數(shù)學(xué)表達(dá)式:

A=lg(1/T)=KCL

A為吸光度T為透射率,是投射光強(qiáng)度比上入射光強(qiáng)度

C為吸光物質(zhì)的濃度L為吸收層厚度K為吸收系數(shù)物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的西光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度C及吸收層厚度L成正比.第9頁(yè)/共16頁(yè)第10頁(yè)/共16頁(yè)第11頁(yè)/共16頁(yè)儀器操作鍵介紹“方式設(shè)定”鍵（MODE）：用于設(shè)置測(cè)試方式“100%T/0ABS”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度)“0%T”鍵：用于自動(dòng)調(diào)整零透射比“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕：用于設(shè)置分析波長(zhǎng)第12頁(yè)/共16頁(yè)樣品測(cè)試操作①打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘②用“波長(zhǎng)設(shè)置”按鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在您將要使用的分析波長(zhǎng)位置上③打開(kāi)樣品室蓋，將擋光體插入比色皿架，并將其推或拉入光路④蓋好樣品室蓋，按“0%T”鍵調(diào)透射比零⑤取出擋光體，蓋好樣品室蓋，按“100%T”調(diào)100%透射比⑥按“方式鍵”（MODE）將測(cè)試方式設(shè)置為吸光度方式(A)⑦將參比溶液和被測(cè)溶液分別倒入比色皿中⑧打開(kāi)樣品室蓋，將盛有溶液的比色皿分別插入比色皿槽中，蓋上樣品室蓋⑨將參比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”調(diào)零A⑩將被測(cè)溶液拉入光路中，此時(shí)，顯示器上所顯示是被測(cè)樣品的吸光度參數(shù)實(shí)驗(yàn)完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿，并蓋好蓋布。第13頁(yè)/共16頁(yè)

使用注意:每次測(cè)量前檢查,檢查波長(zhǎng)是否所需值;比色皿應(yīng)拿磨砂面,不可用手接觸透光面;比色皿在盛裝樣品前,應(yīng)用所盛樣品沖洗兩次,裝樣量為比色皿的2/3容積;向比色皿加樣時(shí),若樣品流到比色皿外壁時(shí),應(yīng)用濾紙點(diǎn)干,切忌用濾紙擦拭,比色皿易出現(xiàn)劃痕;測(cè)量結(jié)束后應(yīng)用蒸餾水清洗比色皿,清洗干凈后放起.第14頁(yè)/共16頁(yè)操作方法

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定取12支試管分兩組，分別加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫（20~25℃）下放置20分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定(30分鐘內(nèi)必須完成測(cè)定)。用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)