實(shí)驗(yàn)六三過氧化氫酶活性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)六三過氧化氫酶活性的測(cè)定第1頁(yè)/共22頁(yè)P(yáng)leasebequiet,上課了??！第2頁(yè)/共22頁(yè)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和分離、純化

1、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)

等電點(diǎn)與它所含的酸堿氨基酸數(shù)目比例有關(guān)等離子點(diǎn)蛋白質(zhì)的一個(gè)特征常數(shù)2蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)維持蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)穩(wěn)定的因素（3點(diǎn)）3蛋白質(zhì)沉淀的方法等電點(diǎn)沉淀法（ 可逆、不變性)

鹽析法 （可逆、不變性）

有機(jī)溶劑沉淀法（可逆或不可逆）

重金屬鹽沉淀法 （變性）

生物堿試劑 （變性）

加熱沉淀法（變性）強(qiáng)酸堿沉淀（不可逆）4蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性（溫和條件、變性因素、常用變性劑）第3頁(yè)/共22頁(yè)蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)第4頁(yè)/共22頁(yè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定

a.根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量b.滲透壓法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量c.沉降分析法（超速離心法）d.※凝膠過濾法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量（分子篩層析）此法比較簡(jiǎn)單，不要求復(fù)雜的儀器，就能精確地測(cè)出Mre.※SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量第5頁(yè)/共22頁(yè)根據(jù)分子大小不同的方法 透析和超過濾利用溶解度差別的純化方法（實(shí)踐最常用的方法a鹽析b有機(jī)溶劑分級(jí)分離）根據(jù)電荷不同的純化方法（PAGE、醋酸纖維素薄膜電泳、離子交換層析）利用選擇性吸附的純化方法利用對(duì)配體的特異生物學(xué)親和層析:一步處理即親和力的純化方法可分離所需蛋白質(zhì)，純度很高

蛋分離純化白質(zhì)的第6頁(yè)/共22頁(yè)（一）蛋白質(zhì)的含量測(cè)定①凱氏定氮法②雙縮尿法③Folin-酚試劑法④紫外吸收法⑤考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法靈敏度高，重復(fù)好⑥膠體金測(cè)定法 靈敏度最高（二）蛋白質(zhì)的純度測(cè)定電泳、沉降、HPLC和溶解度分析等。蛋白質(zhì)的含量測(cè)定和純度鑒定第7頁(yè)/共22頁(yè)植物細(xì)胞DNA提取的方法CTAB法提取植物組織DNASDS法提取植物組織DNA以螯合樹脂、特異性DNA吸附膜、離子交換純化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基礎(chǔ)DNA提取新方法第8頁(yè)/共22頁(yè)植物RNA的提取方法CTAB法、SDS法、快速SDS法、異硫氰酸胍法、Tris-硼酸法和Trizol一步法胍法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等第9頁(yè)/共22頁(yè)電泳圖第10頁(yè)/共22頁(yè)稱取樣品，液氮研磨，加入預(yù)熱的(65℃

)CTAB及β-巰基乙醇

保溫1h,期間不停的搖均吸取上清液,移至新的離心管中,加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），輕緩顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，移至新的離心管中,加等體積氯仿：異戊醇,顛倒混勻,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的異丙醇（預(yù)冷），后4℃/-20℃保溫沉淀10000rpm,10min離心取沉淀，70%乙醇清洗兩次，吹干用TE溶解DNA,然后低溫保存第11頁(yè)/共22頁(yè)

過氧化氫酶活性的測(cè)定

——碘量法實(shí)驗(yàn)三學(xué)時(shí)：3第12頁(yè)/共22頁(yè)生物體內(nèi)重要的三種氧化酶類，其作用均是清除體內(nèi)自由基：POD：過氧化物酶SOD：超氧化物歧化酶CAT：過氧化氫酶第13頁(yè)/共22頁(yè)

1、掌握碘量法測(cè)定過氧化氫酶活性的原理和方法；

2、了解過氧化氫酶的作用。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模旱?4頁(yè)/共22頁(yè)植物在逆境下或衰老時(shí)，由于體內(nèi)活性氧代謝加強(qiáng)而使H2O2發(fā)生累積。H2O2可進(jìn)一步生成氫氧自由基（OH˙）。氫氧自由基（OH˙）是化學(xué)性質(zhì)最活潑的活性氧，可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸，蛋白質(zhì)等生物大分子，并且有非常高的速度常數(shù)，破壞性極強(qiáng)，可使細(xì)胞膜遭受損害，加速細(xì)胞的衰老和解體。過氧化氫酶(catalase；CAT)可以清除H2O2、分解氫氧自由基，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活，因此CAT是植物體內(nèi)重要的酶促防御系統(tǒng)之一，其活性高低與植物的抗逆性密切相關(guān)。二、實(shí)驗(yàn)原理:第15頁(yè)/共22頁(yè)CAT活性大小以一定時(shí)間內(nèi)分解的H2O2量來(lái)表示：在一定條件下，CAT能把H2O2分解為H2O和O2。當(dāng)CAT與H2O2反應(yīng)一定時(shí)間(t)后，再用碘量法測(cè)定未分解的H2O2，以鉬酸銨作催化劑，H2O2與KI反應(yīng)，釋放出游離碘，然后用硫代硫酸鈉滴定碘，反應(yīng)式為：

H2O2（余）+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3--→2NaI+Na2S4O6（連二硫酸鈉）用硫代硫酸鈉分別滴定空白液(可求出總的H2O2量)和反應(yīng)液(可求出未分解的H2O2量)，再根據(jù)二者滴定值之差求出分解的H2O2量。二、實(shí)驗(yàn)原理:第16頁(yè)/共22頁(yè)1、實(shí)驗(yàn)材料：三葉草2、儀器：(1)滴定管(2)研缽(3)容量瓶

(4)移液管(5)三角瓶(100ml)3、試劑：（1）0.05MH2O2（2）0.2MNa2S2O3

（3）1.8MH2SO4

（4）1.5%淀粉溶液（5）10%（NH4)6Mo7O24

（6）20%KI

（7）石英砂

三、實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑：第17頁(yè)/共22頁(yè)1、酶液提?。?/p>

稱取0.5g三葉草，加少量石英砂，2ml水，研成勻漿，移入25ml容量瓶，沖洗研缽數(shù)次，定容，靜置，過濾。2、酶促反應(yīng)：

（1）取錐形瓶2個(gè)，編號(hào)A，B，各加入10ml酶液，之后立即向A瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，終止酶活性，作空白滴定。（2）向A，B兩瓶各加H2O25ml，搖勻，在加入B瓶那一刻起，記錄時(shí)間，5分鐘后迅速向B瓶中加入1.8mol/LH2SO45ml，終止酶活性。3、滴定：

向A，B兩瓶各加1ml20%KI和3滴（NH4）6Mo7O24，搖勻后迅速加入5滴1.5%淀粉溶液，用Na2S2O3進(jìn)行滴定至藍(lán)色恰好消失，記錄兩次消耗Na2S2O3的體積VA(空白)，VB(反應(yīng)液)。四、實(shí)驗(yàn)步驟：

第18頁(yè)/共22頁(yè)稱取0.5g的三葉草研磨過濾、定容至25ml容量瓶A瓶取酶液10ml,,加入硫酸終止酶活性B瓶取酶液10ml,,各加入5mlH2O2，B瓶5min后加入硫酸終止酶活性滴定反應(yīng)第19頁(yè)/共22頁(yè)酶活性測(cè)定管號(hào)酶液(ml)1.8MH2SO4(ml)0.05MH2O2保溫1.8MH2SO4(ml)20%KI溶液(ml)鉬酸銨溶液(滴)淀粉溶液(滴)0.2MNa2S2O3溶液的滴定量A空白10555分鐘-135VA(空白)=B反應(yīng)10-55135VB(反應(yīng)液)=第20頁(yè)/共22頁(yè)1、被分解的H2O2量（mg）=（空白滴定值-樣品滴定值）×N