碩士研究生課現(xiàn)代生物技術(shù)概論劉柱ppt

碩士研究生課現(xiàn)代生物技術(shù)概論劉柱ppt基因工程突出的優(yōu)點(diǎn)打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的界限可以使原核生物與真核生物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使動(dòng)物與植物之間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移可以使人與其他生物間的遺傳信息進(jìn)行相互重組和轉(zhuǎn)移基因工程的主要理論依據(jù)不同基因具有相同的遺傳物質(zhì)(DNA/RNA)基因是可以從DNA上切割下來(lái)的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系

遺傳密碼是通用的(絕少數(shù)除外)可以通過(guò)DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代基因工程的基本技術(shù)路線工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無(wú)53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基重組DNA技術(shù)中常用的工具酶核酸酶分類

核酸內(nèi)切酶：催化水解多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵核酸外切酶：從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核苷酸

Ⅱ型核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性與I型及III型核酸內(nèi)切限制酶不同，II型核酸內(nèi)切酶只有一種多肽，并通常以同源二聚體形式存在。它具有三個(gè)基本特性：a.

在DNA分子雙鏈的特異性識(shí)別序列部位，切割DNA分子產(chǎn)生鏈的斷裂；b.

2個(gè)單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)的；c.

因此，斷裂的結(jié)果形成的DNA片段，也往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端。識(shí)別位點(diǎn)絕大多數(shù)的II型核酸內(nèi)切限制酶，都能夠識(shí)別由4～8個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。我們稱這樣的序列為核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別序列。而限制酶就是從其識(shí)別序列內(nèi)切割DNA分子的，因此識(shí)別序列又稱為核酸內(nèi)切限制酶的切割位點(diǎn)或靶序列。1）有些識(shí)別序列是連續(xù)的(如GATC)，2）有些識(shí)別序列則是間斷的(如GANTC)，N是代表任意一種核苷酸堿基。識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適的反應(yīng)條件下使每條鏈一定位點(diǎn)上的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，產(chǎn)生具有3-OH和5-P基團(tuán)的DNA片段的內(nèi)切脫氧核糖核酸酶。

識(shí)別序列規(guī)律：旋轉(zhuǎn)對(duì)稱或左右互補(bǔ)對(duì)稱。核酸內(nèi)切酶

RestrictionendonucleaseGGATCCCCTAGGBamHⅠ限制性內(nèi)切酶的命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的特征

1）每一種酶都有各自的特異識(shí)別序列2）識(shí)別序列具左右互補(bǔ)對(duì)稱(PstI:GAATTC)3）同位酶對(duì)切割的序列甲基化有不同的限制性反映4）同位酶、同裂酶、同尾酶酶切特點(diǎn)同位酶：識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同。同裂酶：識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來(lái)源不同。限制酶HpaⅡ和MspI是一對(duì)同裂酶，共同的靶子序列是CCGG。同尾酶：識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列。SalI（5`-G

TCGAC-3`）和XhoI(5`-C

TCGAG-3`)的消化片段相連，但所形成的重組片段（5`-GTCGAG-3`）則不能被上述2種酶的任一種酶識(shí)別和切割。

Questions1基因工程的主要理論依據(jù):共6點(diǎn)2核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列的規(guī)律3限制性內(nèi)切酶的命名4同位酶、同裂酶、同尾酶識(shí)別相同序列切點(diǎn)不同識(shí)別位點(diǎn)相同，酶的來(lái)源不同。識(shí)別位點(diǎn)不同，切出片段有相同末端序列。粘性末端：產(chǎn)生的DNA片段末端的一條鏈多出一至幾個(gè)核苷酸。3′端比5′端長(zhǎng)的稱為3′粘性末端，5′端比3′端長(zhǎng)的稱為5′粘性末端。平末端：產(chǎn)生的DNA片段末端是平齊的。影響限制性內(nèi)切酶活性的因素

DNA的純度

DNA的甲基化程度

溫度

緩沖液

反應(yīng)體積和甘油濃度反應(yīng)時(shí)間DNA的純度核酸內(nèi)切限制酶消化DNA底物的反應(yīng)效率，在很大程度上是取決于所使用的DNA本身的純度。污染在DNA制劑中的某些物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸鈉)、以及高濃度的鹽離子等，都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性。為了提高核酸內(nèi)切酶對(duì)低純度DNA的反應(yīng)效率，一般采用如下三種方法：①增加核酸內(nèi)切限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高達(dá)10單位甚至更多些。②擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積，以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋。③延長(zhǎng)酶催化反應(yīng)的保溫時(shí)間。在有些DNA制劑中，尤其是按微量堿法制備的，會(huì)含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在DNA的貯存緩沖液中含有二價(jià)金屬離子螯合劑EDTA，因此在這種制劑中的DNA仍然是穩(wěn)定的。然而在加入了核酸內(nèi)切限制酶緩沖液之后，DNA則會(huì)被DNase迅速地降解掉。要避免發(fā)生這種情況，唯一的辦法就是使用高純度的DNA。DNA的甲基化程度核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制—修飾體系的組成部分，因此識(shí)別序列中特定核苷酸的甲基化作用，便會(huì)強(qiáng)烈地影響酶的活性。為避免產(chǎn)生這樣的問(wèn)題，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大腸桿菌菌株制備質(zhì)粒DNA。酶切消化反應(yīng)的溫度DNA消化反應(yīng)的溫度，是影響核酸內(nèi)切限制酶活性的另一個(gè)重要因素。不同的核酸內(nèi)切限制酶，具有不同的最適反應(yīng)溫度，而且彼此之間有相當(dāng)大的變動(dòng)范圍。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度都是37℃，但也有許多例外的情況，它們要求37℃以外的其它反應(yīng)溫度。其中有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度低于標(biāo)準(zhǔn)的37℃，例如SmaI是25℃、ApaI是30℃；有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度則高于標(biāo)準(zhǔn)的37℃，例如MaeI是45℃、BclI是50℃、MaelII是55℃；還有些核酸內(nèi)切限制酶的最適反應(yīng)溫度可高達(dá)60℃以上，消化反應(yīng)的溫度低于或高于最適溫度，都會(huì)影響核酸內(nèi)切限制酶的活性，甚至最終導(dǎo)致完全失活。DNA的分子結(jié)構(gòu)DNA分子的不同構(gòu)型對(duì)核酸內(nèi)切限制酶的活性也有很大的影響。某些核酸內(nèi)切限制酶切割超螺旋的質(zhì)粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化線性DNA的高出許多倍，最高的可達(dá)20倍。核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液核酸內(nèi)切酶的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液的組份包括：氯化鎂、氯化納或氯化鉀、Tris-HCl,?-巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常發(fā)揮，是絕對(duì)地需要二價(jià)的陽(yáng)離子，通常是Mg2+。不正確的NaCl或Mg2+濃度，不僅會(huì)降低限制酶的活性，而且還可能導(dǎo)致識(shí)別序列特異性的改變。緩沖液Tris—HCl的作用在于使反應(yīng)混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳數(shù)值的范圍之內(nèi)。對(duì)絕大多數(shù)限制酶來(lái)說(shuō)，在pH=7．4的條件下，其功能最佳。巰基試劑對(duì)于保持某些核酸內(nèi)切限制酶的穩(wěn)定性是有用的，而且還可保護(hù)其免于失活。但它同樣也可能有利于潛在污染雜質(zhì)的穩(wěn)定性。核酸內(nèi)切限制酶的緩沖液有一部分核酸內(nèi)切限制酶對(duì)于鈉離子或鉀離子濃度變化反應(yīng)十分敏感，而另一部分核酸內(nèi)切限制酶則可適應(yīng)較廣的離子強(qiáng)度的變化幅度。

在“非最適的”反應(yīng)條件下(包括高濃度的核酸內(nèi)切限制酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸內(nèi)切限制酶識(shí)別序列的特異性便會(huì)發(fā)生“松動(dòng)”，從其“正確”識(shí)別序列以外的其它位點(diǎn)切割DNA分子。有些核酸內(nèi)切限制酶的切割特異性，受所用的緩沖液成份的影響比較明顯。例如，最常用的EcoRI限制酶，在正常的情況下，是在G

AATTC識(shí)別序列處發(fā)生切割作用的，但如果緩沖液中的甘油濃度超過(guò)5％(V／V)，那么其識(shí)別序列的特異性就會(huì)發(fā)生松動(dòng)，可在AATT或PuPuATPyPy序列處發(fā)生切割作用。EcoRI限制酶的這種特殊的識(shí)別能力，通常叫做星號(hào)活性，以EcoRI*表示。限制性內(nèi)切核酸酶的切割方法: