農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB15670-1995農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法Toxicologicaltestmethodsof

Pesticidesforregistration主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)的方法、條件的基本要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于為農(nóng)藥登記而進(jìn)行的毒理學(xué)試驗(yàn)。急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)．1目的求出試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的半數(shù)致死劑量（LD50）；通過(guò)觀察急性毒性效應(yīng)的臨床表現(xiàn)，初步估測(cè)毒作用的靶器官和可能的毒作用機(jī)理；為亞慢性、慢性和其他毒性試驗(yàn)的劑量水平設(shè)計(jì)提供參考；為急性毒性分級(jí)和制定安全防護(hù)措施提供依據(jù)。．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥和制劑。．3試驗(yàn)動(dòng)物2．3．1主要選用品系、遺傳背景明確的初年大鼠。各劑量組內(nèi)同性別動(dòng)物體重差異應(yīng)小于平均體重的10%，組間同性別動(dòng)物體重均值差異應(yīng)小于5%。2．3．2每一劑量組的大鼠8~10只（雌雄各半），試驗(yàn)前要對(duì)動(dòng)物觀察一周，確認(rèn)健康后，方可使用。2．4劑量分組2．4．1至少應(yīng)設(shè)4~5個(gè)劑量組，各劑量組之間要有適當(dāng)?shù)膭┝块g距。以便各組出現(xiàn)不同程度的毒性效應(yīng)（死亡率），求得劑量效應(yīng)曲線及LD50。4.2如劑量達(dá)5000mg/kg體重以上，動(dòng)物仍不出現(xiàn)死亡，則不需要進(jìn)行更高劑量的試驗(yàn)。給藥方法及觀察時(shí)間動(dòng)物給藥前應(yīng)隔夜禁食但不禁水，稱重后，一次灌胃給藥，給藥后至少間隔2h進(jìn)食。灌胃量大鼠按100g體重給1mL,小鼠按20g體重給0.4mL計(jì)算，灌胃可用水溶液、油溶液或懸液。5.3給藥后立即觀察并記錄動(dòng)物的中毒表現(xiàn)，癥狀出現(xiàn)和消失的時(shí)間及死亡時(shí)間。給藥當(dāng)日應(yīng)連續(xù)觀察，其后，每日至少觀察2次，觀察期為14d。如在給藥96h后出現(xiàn)遲發(fā)性新效應(yīng)，則應(yīng)延長(zhǎng)觀察期至3周或4周。觀察指標(biāo)中毒癥狀全面觀察中毒的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程和規(guī)律以及中毒特點(diǎn)和毒作用的靶器官。觀察的系統(tǒng)包括：a.中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)肌肉系統(tǒng)：體位異常、叫聲異常、不安、呆滯、痙攣、抽搐麻痹、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、對(duì)外反應(yīng)過(guò)敏或遲鈍；b.植物神經(jīng)系統(tǒng)：瞳孔擴(kuò)大或縮小、流涎或流淚；c.呼吸系統(tǒng)：鼻孔流液、鼻翼煽動(dòng)、呼吸深緩、呼吸過(guò)速、蜂腰；d.泌尿生殖系統(tǒng)：會(huì)陰部污穢、有分泌物、陰道或乳房腫脹；e.皮膚和毛：皮膚充血、紫紺、被毛蓬松、污穢；f.眼：眼球突出、結(jié)膜充血、角膜混濁；g.消化系統(tǒng)：腹泄、厭食。體重給藥前、死亡時(shí)各稱量一次體重，觀察期間每3d稱量一次。6.3一般不做病理組織學(xué)檢查和生化指標(biāo)檢驗(yàn)，但對(duì)死亡動(dòng)物應(yīng)做大體病理學(xué)觀察。如24h以上的存活動(dòng)物，肉眼檢查有病變時(shí)應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。2.7結(jié)果評(píng)定2.7.1用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LD50值。計(jì)算方法見附錄A（補(bǔ)充件）。2.7.2按農(nóng)藥的急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定（見表1）。表1急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別經(jīng)口LD50,mg/kg劇毒<5高毒5-50中毒50-5003急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)?zāi)康牧私廪r(nóng)藥對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物皮膚直接接觸引起局部皮膚損傷、全身中毒的特征等毒性效應(yīng)，求出半數(shù)致死劑量（LD50）,為制定農(nóng)藥生產(chǎn)和應(yīng)用中的防護(hù)措施提供依據(jù)。3．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥和制劑。3．3試驗(yàn)動(dòng)物3．3．1為有足夠的涂藥面積，首選成年大鼠，體重要求200-300g。3．3．2各劑量組大鼠8~10只（雌雄各半）。3．4劑量分組3．4．1至少應(yīng)設(shè)4個(gè)劑量組，各劑量組應(yīng)有一定的間距，使給藥組能出現(xiàn)毒性表現(xiàn)和死亡。3.4.2如果2000mg/kg劑量仍不出現(xiàn)死亡時(shí)，則不需要再進(jìn)行高劑量試驗(yàn)。3.5給藥方法及觀察時(shí)間3.5.1給藥前24h背部去毛，注意勿損傷皮膚，涂藥面積應(yīng)占體表面積10%,大鼠4X5cm八2,兔12X14cm八2,豚鼠7X10cm八2。3．5．2液體農(nóng)藥用原藥液，粉末農(nóng)藥用水或溶劑稀釋。3．5．3先將動(dòng)物固定，在略小于剃毛面積內(nèi)進(jìn)行定量敷藥，然后覆蓋一個(gè)與脫毛面積相當(dāng)?shù)暮惺秸?，再用膠布固定。以防止動(dòng)物舔食試驗(yàn)藥品。3.5.4涂藥持續(xù)時(shí)間為4h。3.5.5涂藥4h后取下罩盒，用溫水洗去皮膚上的試驗(yàn)農(nóng)藥，再進(jìn)行局部觀察。3.5.6觀察時(shí)間為2周。觀察指標(biāo)中毒的臨床表現(xiàn)，參照2.6.1。死亡時(shí)間及死亡率。結(jié)果評(píng)定3.7.1用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LD50值。計(jì)算方法見附錄A（補(bǔ)充件）。3.7.2按農(nóng)藥的急性經(jīng)皮毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定（見表2）。表1急性經(jīng)皮毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別經(jīng)皮LD50(4h),mg/kg劇毒<20高毒20-200中毒200-2000低毒>20004急性吸入毒性試驗(yàn)4．1目的測(cè)試可能經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體的農(nóng)藥（尤其是揮發(fā)性強(qiáng)的農(nóng)藥）對(duì)呼吸道及全身的損傷及其危害程度。求出吸入接觸的半數(shù)致死濃度（LC50）,為農(nóng)藥的安全評(píng)價(jià)和制定生產(chǎn)應(yīng)用中的防護(hù)措施提供依據(jù)。4．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥和制劑。4．3試驗(yàn)動(dòng)物4．3．1一種以上的哺乳動(dòng)物，大鼠為首選動(dòng)物。4．3．2動(dòng)物性別、體重和每組動(dòng)物數(shù)量的要求同2.3。4．4劑量分組4．4．1至少應(yīng)設(shè)3個(gè)出現(xiàn)毒性效應(yīng)直至死亡的劑量組。4.2如果以濃度2000mg/m3給藥2h仍無(wú)死亡，則無(wú)需再做高濃度試驗(yàn)。4.5給藥方法及觀察時(shí)間給藥方式包括鼻、頭部接觸和全身置于染毒柜內(nèi)接觸兩種方式。染毒柜內(nèi)應(yīng)保持恒定的空氣流量、農(nóng)藥濃度、溫度及濕度，并要求柜內(nèi)保持微負(fù)以免農(nóng)藥外漏。4.5.3吸入給藥一般為2h。5.4給藥后至少觀察14d。觀察指標(biāo)中毒的臨床表現(xiàn)，參照2.6.1。死亡時(shí)間及死亡率。結(jié)果評(píng)定4.7.1用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LC50值。計(jì)算方法見附錄A（補(bǔ)充件）。4.7.2按農(nóng)藥的急性吸入毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定（見表3）。表3急性吸入毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)級(jí)別LC50(2h),mg/m八3劇毒<20高毒20-200中毒200-2000低毒>20005.急性皮膚刺激試驗(yàn)?zāi)康臏y(cè)定農(nóng)藥對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚是否有刺激或腐蝕作用，估計(jì)人體接觸該農(nóng)藥時(shí)可能出現(xiàn)的類似危害。5．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥和制劑。5．3試驗(yàn)動(dòng)物5．3．1兔或豚鼠，首選動(dòng)物為白色家兔。5．3．2至少4只皮膚完好的健康動(dòng)物。5．4劑量5.4.1一次涂藥量為0.5mL或0.5g。5．4．2動(dòng)物自身皮膚做為對(duì)照。試驗(yàn)步驟5.5.1試驗(yàn)前24h將背部毛剪掉，面積約6cm八2。5.5.2涂上試驗(yàn)農(nóng)藥，再用紗布蓋上，以膠布固定或采用其他封閉性蓋罩，避免試驗(yàn)動(dòng)物舔食。5.5.3涂敷持續(xù)時(shí)間一般為4h。時(shí)間結(jié)束時(shí)，用水或適當(dāng)?shù)娜軇┫慈埩舻霓r(nóng)藥，但注意不要操作皮膚。5.5.4根據(jù)需要做進(jìn)一步的觀察，以確定反應(yīng)的可逆性。一般觀察期不超過(guò)14d。結(jié)果評(píng)定每一只動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果按表4進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分，計(jì)算出平均分值，按表5進(jìn)行強(qiáng)度評(píng)定。表4皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分

癥壯及程序積分A紅斑形成無(wú)紅斑勉強(qiáng)可見明顯紅斑中等至嚴(yán)重紅斑紫紅色斑并有焦痂形成B水腫形成無(wú)水腫勉強(qiáng)可見水腫隆起輪廓清楚水腫隆起輪廓清楚水腫隆起約1mm水腫隆起超過(guò)1mm,范圍擴(kuò)大0123401234總分A+B表5皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)強(qiáng)度分值無(wú)刺激性0-0.4輕度刺激性0.5-1.9中等刺激性2.0-5.9強(qiáng)刺激性6.0-8.0注：pHW2或pHNH.5的農(nóng)藥可不進(jìn)行本試驗(yàn)6眼刺激試驗(yàn)6．1目的了解試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)眼睛的刺激作用和程度，為農(nóng)藥生產(chǎn)和使用中的安全防護(hù)提供依據(jù)。6．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥和制劑，但對(duì)具有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性質(zhì)的化合物(pHW2,pHN11.5)不需做此試驗(yàn)。6．3試驗(yàn)動(dòng)物成年的白色家兔至少4只。試驗(yàn)前24h檢查試驗(yàn)家兔雙眼，有異常者不得使用。6．4劑量液體農(nóng)藥或100倍稀釋液0.1mL,粒狀農(nóng)藥不超過(guò)100mg,且應(yīng)先將顆粒磨成細(xì)粉。6．5給藥方法及觀察時(shí)間6．5．1將一側(cè)下眼瞼輕輕下拉，把試驗(yàn)農(nóng)藥滴入結(jié)膜囊內(nèi)，為防止藥液外溢，立即輕輕閉合眼瞼約1min。如果用噴霧給藥法，將眼瞼分開，在眼前方10cm距離處迅速噴霧1s。6.5.2給藥后24h內(nèi)不洗眼。6．5．3對(duì)側(cè)眼為對(duì)照。6.5.4給藥后于1,24,48,72h分別檢查眼睛。如72h仍無(wú)刺激反應(yīng)時(shí)，則終止試驗(yàn)。6．5．5如果出現(xiàn)角膜操作或眼睛其他部位出現(xiàn)反應(yīng)，要繼續(xù)觀察損傷的經(jīng)過(guò)及其可逆性，觀察期最長(zhǎng)不超過(guò)21d。6.5.672h刺激反應(yīng)仍不消退時(shí)，至少另選4只家兔觀察洗眼效果。即滴入藥物后分別在4s和30s時(shí)用生理鹽水洗眼5min,觀察洗眼后的眼睛反應(yīng)情況。觀察指標(biāo)除了觀察結(jié)膜、角膜、虹膜外，還應(yīng)注意其他部位的損害。結(jié)果評(píng)定按表6將每只動(dòng)物的角膜、虹膜和結(jié)膜的刺激反應(yīng)的分值相加，即是一只動(dòng)物眼刺激反應(yīng)的總積分。每個(gè)動(dòng)物的刺激反應(yīng)積分的總和除以動(dòng)物數(shù)，就是該試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)眼刺激性的最后分值。再按表7評(píng)定眼刺激程度。表6眼損傷程度評(píng)分部位及程度積分角膜A混濁（以最致密部位為準(zhǔn)）無(wú)混濁散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見01續(xù)表6

部位及程度積分半透明區(qū)易分辯，虹膜模糊不清出現(xiàn)灰白半透明區(qū)，虹膜細(xì)節(jié)不清，瞳孔大小勉強(qiáng)看清角膜不透明，由于混濁，虹膜無(wú)法辨認(rèn)B角膜受損范圍<1/41/4-1/21/2-3/43/4-12341234最高積分80（積分AXBX5）虹膜正常鄒折明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍有輕度充血，瞳孔對(duì)光仍有反應(yīng)出血，肉眼可見破壞，對(duì)光無(wú)反應(yīng)（或出現(xiàn)其中之反應(yīng)）012最高積分10（積分x5）結(jié)膜A充血狀態(tài)（系指瞼結(jié)膜、球結(jié)膜部位的血管）01

血管正常充血血管充血呈鮮紅色血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色B水腫無(wú)輕微水腫(包括瞬膜)明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合C分泌物無(wú)少量分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著分泌物使整個(gè)眼區(qū)潮濕或粘著23012340123最高積分20[A+B+C)X2]角膜、虹膜、結(jié)膜反應(yīng)累加最高積分110(80+10+20)表7眼刺激性分級(jí)刺激強(qiáng)度眼刺激積分指數(shù)(I.A.O.I)眼刺激的平均指數(shù)(M.I.O.I)無(wú)刺激性0-548h0輕度刺激性5-1548h5輕度至中度刺激性15-304d5中度刺激性30-607d20中度至重度刺激性60-807d40重度刺激性80-1107皮膚變態(tài)反應(yīng)（致敏）試驗(yàn)7．1目的測(cè)試動(dòng)物在反復(fù)接觸農(nóng)藥后，機(jī)體產(chǎn)生免疫傳遞的皮膚反應(yīng)的可能性，從而確定農(nóng)藥的變態(tài)反應(yīng)性（致敏）。7．2試驗(yàn)農(nóng)藥制劑。7．3試驗(yàn)動(dòng)物豚鼠、每組動(dòng)物數(shù)10~20只。7．4劑量致敏（誘導(dǎo)）濃度允許引起皮膚輕度刺激反應(yīng)（即最高耐受濃度）。激發(fā)濃度一般低于致敏濃度，不得引起原發(fā)刺激性炎癥反應(yīng)。7．5試驗(yàn)步驟7．5．1接觸致敏的發(fā)病過(guò)程包括致敏和激發(fā)兩個(gè)階段。a.致敏接觸實(shí)驗(yàn)前24h將動(dòng)物背部左側(cè)去毛3cmX3cm。將試驗(yàn)農(nóng)藥0.1?0.2ml涂在2cmX2cm濾紙上，并將其敷貼在去毛區(qū)，用兩層紗布，一層油紙或不透水塑料膜覆蓋，再以無(wú)刺激膠布封閉固定，持續(xù)6h。第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。b.激發(fā)接觸實(shí)驗(yàn)前24h將動(dòng)物背部右側(cè)去毛2cmX2cm。末次致敏后14?28d,將0.1?0.2mL或低于誘導(dǎo)濃度的試驗(yàn)農(nóng)藥斑貼于右側(cè)去毛區(qū)，覆蓋方法同751a.持續(xù)6h,去掉斑貼及試驗(yàn)農(nóng)藥后，每日觀察至第12d。如無(wú)致變，可再次激發(fā)以確定試驗(yàn)農(nóng)藥能否引起過(guò)敏反應(yīng)。7.5.2試驗(yàn)須設(shè)陽(yáng)性或陰性對(duì)照組，陰性對(duì)照組僅給予激發(fā)接觸。7.6結(jié)果評(píng)定將出現(xiàn)皮膚紅斑或水腫（不論程度輕重）的動(dòng)物數(shù)除以動(dòng)物總數(shù)，求出動(dòng)物致敏率，再按表8進(jìn)行致敏率強(qiáng)度評(píng)定。表8致敏率強(qiáng)度分級(jí)致敏率分級(jí)強(qiáng)度分類0-8I弱致敏物9-28II輕度致敏物續(xù)表8致敏率分級(jí)強(qiáng)度分類29-64III中度致敏物65-80W強(qiáng)度致敏物81-100V極強(qiáng)度致敏物8亞急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)8．1目的通過(guò)經(jīng)口途徑在1~4周的時(shí)期內(nèi)，連續(xù)多次給予不同劑量的試驗(yàn)農(nóng)藥，觀察因試驗(yàn)農(nóng)藥的蓄積作用所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，確定亞急性無(wú)作用劑量和靶器官，并為亞慢性或慢性毒性試驗(yàn)的劑量設(shè)定提供依據(jù)。8．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。8．3試驗(yàn)動(dòng)物8．3．1首選大鼠。作為長(zhǎng)期試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)時(shí)，兩種試驗(yàn)應(yīng)使用同一種屬和品系的動(dòng)物。8．3．2選用大鼠的年齡一般為6~8周，體重變異應(yīng)不大于平均體重的10%。8．3．3每劑量組至少10只動(dòng)物，雌雄各半。若試驗(yàn)過(guò)程中需要提前剖殺一些動(dòng)物檢查，或需要一個(gè)觀察毒性反應(yīng)可逆性的附加組時(shí)，則在試驗(yàn)開始時(shí)要作相應(yīng)的增加。8．4劑量分組一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。根據(jù)類似化合物的資料，預(yù)計(jì)經(jīng)口給藥劑量超過(guò)1000mg/kg不會(huì)產(chǎn)生毒性時(shí)，可設(shè)二個(gè)劑量組。8．4．1高劑量組應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng)。8．4．2中劑量組應(yīng)產(chǎn)生輕微的可觀察到的毒性反應(yīng)。8．4．3低劑量組不應(yīng)出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)，但須超過(guò)人的可能接觸劑量。8．4．4對(duì)照組除了不接觸試驗(yàn)農(nóng)藥外，其他處理均應(yīng)與試驗(yàn)組完全相同。8．5給藥方法將試驗(yàn)農(nóng)藥滲入飼料或溶于飲水中，以固定濃度喂養(yǎng)或按動(dòng)物體重以固定劑量通過(guò)胃管灌胃。作為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的預(yù)備試驗(yàn)時(shí)，兩種試驗(yàn)應(yīng)采用相同的給藥方式。喂養(yǎng)給藥應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。管飼法每天在同一時(shí)間給藥，并按一定的間隔時(shí)間（每周），根據(jù)體重調(diào)整給藥量。8．6給藥時(shí)間連續(xù)給藥7?28d或5d/周。為了觀察毒性反應(yīng)的可逆性，附加組動(dòng)物在停止給藥后再飼養(yǎng)14d，再進(jìn)行毒性效應(yīng)的測(cè)試。8．7臨床觀察和檢查8．7．1觀察給藥期間和給藥后試驗(yàn)動(dòng)物的毒性效應(yīng)、出現(xiàn)時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和程度。如發(fā)現(xiàn)瀕死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖。每周至少測(cè)量一次進(jìn)食量（或飲水量）和體重。8．7．2血液學(xué)檢查檢測(cè)項(xiàng)目包括血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)及其分類等8．7．3血液生化檢查檢測(cè)項(xiàng)目一般應(yīng)包括肝、腎功能，如血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、尿素氮、肌酐等。必要時(shí)還須檢測(cè)總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、總膽紅素、高鐵血紅蛋白、膽堿酯酶、鉀、鈉、鈣、磷等。8．8病理學(xué)檢查8．8．1系統(tǒng)解剖所有試驗(yàn)動(dòng)物包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行完整的系統(tǒng)解剖和仔細(xì)的肉眼觀察。肉眼可見的損傷或可疑損傷部位都應(yīng)采樣固定，作進(jìn)一步組織學(xué)檢查。8．8．2臟器重量稱取脾、肝、腎、腎上腺、睪丸等臟器重量并計(jì)算其臟器系數(shù)（臟器重/體重x100%）。8．8．3組織學(xué)檢查對(duì)照組和高劑量組動(dòng)物以及系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳細(xì)的組織學(xué)檢查。其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時(shí)進(jìn)行。附加組動(dòng)物應(yīng)對(duì)試驗(yàn)組已確證有毒性效應(yīng)的組織和器官重點(diǎn)檢查。檢查臟器一般包括腦、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸、卵巢和其他肉眼觀察發(fā)現(xiàn)有損害或大小出現(xiàn)變化的器官。一般以肝、腎及可穎靶器官為主。此外，還應(yīng)包括與農(nóng)藥直接接觸的組織或器官，如胃等。9亞急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)9．1目的按經(jīng)皮方式反復(fù)給藥21d,觀察由此產(chǎn)生的不良反應(yīng)，求出無(wú)作用劑量。9．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。9．3試驗(yàn)動(dòng)物按8.3進(jìn)行。9．4劑量分組9．4．1一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。必要時(shí)還應(yīng)設(shè)溶劑對(duì)照組。9．4．2最高劑量組應(yīng)出現(xiàn)明顯的中毒效應(yīng)，但死亡動(dòng)物數(shù)不能妨礙有效的評(píng)定。9.4.3如果用1000mg/kg體重以上的劑量給藥而未出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)，則不必再設(shè)其他更高劑量組。9.5給藥方法.5.1剃去動(dòng)物背部體毛，在無(wú)損部分均勻地涂敷試驗(yàn)農(nóng)藥，并用無(wú)刺激性的塑料膜和紗布覆蓋，膠布固定，使農(nóng)藥與皮膚保護(hù)良好的接觸，并防止被動(dòng)物舔食。5.2涂藥面積一般不少于動(dòng)物體表面積的10%（大鼠約為20?40cm八2）。高毒農(nóng)藥涂藥面積可略減，涂布時(shí)要盡量薄而均勻。9．5．3如動(dòng)物敷用農(nóng)藥后，產(chǎn)生嚴(yán)重的皮膚刺激和損傷，要降低試驗(yàn)農(nóng)藥的濃度，重新進(jìn)行試驗(yàn)。9．6給藥時(shí)間每天一次，每次4?6h,或5d/周，共給藥2支。為了觀察毒性效應(yīng)的可逆性，附加組動(dòng)物在停止給藥后再飼養(yǎng)14d，再進(jìn)行毒效反應(yīng)的測(cè)試。9．7臨床觀察和檢查按8.7進(jìn)行。9．8病理學(xué)檢查除按8.8進(jìn)行外，尚需增加與農(nóng)藥直接接觸的皮膚檢查。10亞急性吸入毒性試驗(yàn)10．1目的在規(guī)定的3-4周時(shí)期內(nèi)，按吸入方式反復(fù)給藥，觀察由于連續(xù)經(jīng)呼吸道給藥所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，求出無(wú)作用劑量。10．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。10．3試驗(yàn)動(dòng)物按8.3進(jìn)行。10．4劑量分組按8.4進(jìn)行。10．5給藥方法5．1應(yīng)維持被檢農(nóng)藥在染毒柜中分布均勻，氧含量不低于19%。10．5．2濃度監(jiān)測(cè)染毒柜內(nèi)被檢農(nóng)藥濃度應(yīng)定期或連續(xù)監(jiān)測(cè)，并盡可能地維持恒定。10．6染毒時(shí)間每天一次，每次4h,或5d/周。連續(xù)染毒21-28d。停止染毒后，附加組動(dòng)物再飼養(yǎng)14d,觀察毒性反應(yīng)的可逆性。10．7臨床觀察和檢查按8.7進(jìn)行。10．8病理學(xué)檢查除按8.8進(jìn)行外，尚需增加與農(nóng)藥直接接觸的呼吸系統(tǒng)，如肺等的檢查。11亞慢性經(jīng)口毒性試驗(yàn)11．1目的明確試驗(yàn)農(nóng)藥的亞慢性經(jīng)口毒性效應(yīng)的表現(xiàn)，取得試驗(yàn)農(nóng)藥亞慢性經(jīng)口的最大無(wú)作用劑量參數(shù)，為試驗(yàn)農(nóng)藥慢性毒性試驗(yàn)提供劑量參考數(shù)據(jù)。11．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。11．3試驗(yàn)動(dòng)物11．3．1首選大鼠，4-6周齡，雌雄各半，組間同性別動(dòng)物體重均值差異應(yīng)小于平均體重的10%。11．3．2動(dòng)物數(shù)量各組雌雄大鼠均不少于10只。試驗(yàn)中間剖殺時(shí)，應(yīng)相應(yīng)增加。11．4試驗(yàn)期3-6個(gè)月。11．5劑量分組一般設(shè)三個(gè)劑量組和一個(gè)對(duì)照組。11．5．1高劑量組應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生較明顯的毒性效應(yīng)，但動(dòng)物死亡不應(yīng)超過(guò)10%。11．5．2中劑量組應(yīng)使動(dòng)物產(chǎn)生輕微的毒性效應(yīng)。若設(shè)多個(gè)中劑量組時(shí)，應(yīng)產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)。11．5．3低劑量組不應(yīng)引起任何毒性效應(yīng)，屬無(wú)作用劑量。11．5．4對(duì)照組除不接觸試驗(yàn)農(nóng)藥外，其他應(yīng)與試驗(yàn)組相同，當(dāng)試驗(yàn)農(nóng)藥為制劑，對(duì)其助劑、添加劑等的生物活性不清楚時(shí)，還應(yīng)設(shè)相應(yīng)的助劑對(duì)照組。11．6給藥途徑11．6．1給藥方式混入飼料或溶于飲水。連續(xù)給予動(dòng)物，每周7d。若因試驗(yàn)農(nóng)藥引起飼料和飲水的適口性不良，影響動(dòng)物正常攝入量時(shí)，可用管飼法。6．2除營(yíng)養(yǎng)素外，混入飲料的試驗(yàn)農(nóng)藥一般不應(yīng)超過(guò)5%。飼料或飲水中的試驗(yàn)農(nóng)藥濃度應(yīng)定期監(jiān)測(cè)，觀察其均勻性和穩(wěn)定性。11．7臨床觀察和檢查11．7．1臨床觀察外觀體征、行為活動(dòng)及糞便形狀等每天逐個(gè)觀察。詳細(xì)記錄毒性效應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間和變化，如發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l死動(dòng)物應(yīng)及時(shí)解剖。體重和食物消耗量每周測(cè)量一次。11．7．2血液學(xué)檢查檢查指標(biāo)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、血紅蛋白含量等。檢測(cè)時(shí)間為試驗(yàn)開始時(shí)和3個(gè)月后結(jié)束時(shí)進(jìn)行，每次檢查各劑量組雌雄大鼠至少各6只，非嚙齒類動(dòng)物則全部檢查。11．7．3尿液檢查檢查項(xiàng)目包括外觀、pH值、蛋白、糖、隱血（半定量）和沉淀物鏡檢（半定量）。檢測(cè)時(shí)間和數(shù)量同血液檢查，并盡可能同一動(dòng)物檢查。11．7．4血液生化檢查檢測(cè)項(xiàng)目包括血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶、丙氨酸基轉(zhuǎn)換酶、堿性磷酸酶、尿素氮、肌酐、總蛋白、白蛋白、血糖、總膽固醇、總膽紅素、膽堿酯酶等。11．8病理學(xué)檢查11．8．1系統(tǒng)解剖所有試驗(yàn)動(dòng)物包括試驗(yàn)過(guò)程中死亡動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行完整系統(tǒng)解剖和詳盡的肉眼觀察。所有肉眼可見的病變或可疑病變組織都應(yīng)留樣固定，作進(jìn)一步病理組織學(xué)檢查。11．8．2臟器重量稱取腦、心、肺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸等臟器重量并計(jì)算其臟器系數(shù)（臟器重/體重X100%）。11．8．3病理組織學(xué)檢查對(duì)照組和高劑量組動(dòng)物及系統(tǒng)解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)的異常組織均需作詳盡的組織學(xué)檢查。其他劑量組一般僅在高劑量組有異常發(fā)現(xiàn)時(shí)才進(jìn)行組織學(xué)檢查。檢查臟器一般包括腦、脊髓、心、肺、肝、脾、腎、胰、胃、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、腎上腺、垂體、甲狀腺（包括甲狀旁腺）、胸腺、睪丸、附睪、前列腺、卵巢、子宮、乳腺、皮膚、肌肉、骨、淋巴結(jié)、眼球等。吸入染毒時(shí)，尚應(yīng)包括呼吸道。11．9結(jié)果評(píng)定在仔細(xì)總結(jié)研究各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，并注意對(duì)照組與劑量組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和各劑量間的劑量反應(yīng)關(guān)系的基礎(chǔ)上，評(píng)定以下內(nèi)容。11．9．1試驗(yàn)農(nóng)藥的動(dòng)物經(jīng)口毒性效應(yīng)的主要表現(xiàn)。11．9．2試驗(yàn)農(nóng)藥的亞慢性經(jīng)口動(dòng)物最大無(wú)作用劑量。9．3可供參考的試驗(yàn)農(nóng)藥動(dòng)物經(jīng)口慢性毒性試驗(yàn)的適宜劑量范圍。蓄積毒性試驗(yàn)12．1目的了解試驗(yàn)農(nóng)藥蓄積毒性的強(qiáng)弱，并為慢性毒性試驗(yàn)及其他有毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供參考。12．2試驗(yàn)農(nóng)藥一般用原藥，當(dāng)大鼠經(jīng)口LD50大于5000mg/kg,或已作過(guò)代謝試驗(yàn)有半衰期（tl/2）數(shù)據(jù)的，可免去此項(xiàng)試驗(yàn)。12．3試驗(yàn)動(dòng)物剛成年的哺乳動(dòng)物，選用大鼠或小鼠，雌雄各半。無(wú)經(jīng)口LD50數(shù)據(jù)者，需預(yù)測(cè)其經(jīng)口LD50。12．4給藥方式采用經(jīng)口方式。為了準(zhǔn)確掌握給藥劑量，須采用灌胃法。.5劑量固定的20d蓄積法12．5．1劑量分組將試驗(yàn)動(dòng)物機(jī)分成四個(gè)劑量組，低劑量為1/20LD50,順次為1/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四個(gè)劑量組。另設(shè)一個(gè)陰性（不給藥）對(duì)照組，每組動(dòng)物為10只，雌雄各半。給藥時(shí)間劑量組動(dòng)物每日一次定時(shí)給藥，連續(xù)給藥20d。對(duì)照級(jí)除不給試驗(yàn)農(nóng)藥外，其他條件均與劑量組相同。觀察指標(biāo)各劑量組雌雄合計(jì)的動(dòng)物死亡數(shù)量。12．5．4結(jié)果評(píng)定各劑量組均無(wú)死亡，好為蓄積性不明顯；如僅高劑量（1/2LD50）組有死亡，其他組均無(wú)死亡，則為弱蓄積性；如低劑量組無(wú)死亡，其他各組間死亡數(shù)有劑量反應(yīng)關(guān)系時(shí)，則為中等蓄積性；如低劑量組有死亡，且有劑量反應(yīng)關(guān)系，則為強(qiáng)蓄積性。12．6劑量遞增蓄積系數(shù)法12．6．1劑量分組將試驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成雌雄兩組，每組20只。12．6．2給藥時(shí)間及劑量以4d為一期，連續(xù)給藥。第一期每只動(dòng)物給藥劑量為0.1LD50,以后各期順次遞增50%，即第二期為0.15LD50，第三期為0.225LD50，依次類推，直至雌雄兩組合計(jì)死亡一半（20只），或繼續(xù)給藥至累計(jì)劑量達(dá)5.0LD50以上（20d）為止。12.6.3給藥期間每期（4d）須按實(shí)測(cè)動(dòng)物體重，計(jì)算給藥絕對(duì)量。12.6.4結(jié)果計(jì)算停止給藥后按式（1）計(jì)算蓄積系數(shù)K：K=LD50（n）/LD50（1）（1LD50(n)試驗(yàn)動(dòng)物在給藥期間每只動(dòng)物共攝入試驗(yàn)農(nóng)藥相當(dāng)?shù)腖D50數(shù)；LD50(1)試驗(yàn)農(nóng)藥對(duì)本試驗(yàn)動(dòng)物的經(jīng)口LD50劑量。12．6．5結(jié)果評(píng)定按下列標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定被檢農(nóng)藥蓄積毒性強(qiáng)弱：K<1高度蓄積性；KN1明顯蓄積性；KN3中等蓄積性：KN5輕度蓄積性。13遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)13．1目的了解試驗(yàn)農(nóng)藥的遲發(fā)性神經(jīng)毒性，求出遲發(fā)性神經(jīng)毒性無(wú)作用劑量。13．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。13．3試驗(yàn)動(dòng)物13．3．1選用遺傳背景明確、健康、步態(tài)正常的母雞，雞齡8~14個(gè)月，體重l.5-2kg。13．3．2數(shù)量每劑量組母雞數(shù)量應(yīng)保證在觀察結(jié)束時(shí)存活至少有6只。到期處死，如需觀察恢復(fù)情況，則應(yīng)在開始實(shí)驗(yàn)時(shí)增加延長(zhǎng)觀察期的動(dòng)物數(shù)。13．4給藥方法13．4．1劑量分組一般設(shè)三個(gè)不同劑量的試驗(yàn)組，一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組和一個(gè)空白對(duì)照組。其賦形劑等生物活性不明確時(shí)應(yīng)增設(shè)一個(gè)賦形劑對(duì)照組。13.4.1.1高劑量組：根據(jù)：LD50和預(yù)試驗(yàn)確定，一般采用LD50劑量。觀察期結(jié)束時(shí)可引起試驗(yàn)動(dòng)物膽堿酯酶活性下降，以及部分動(dòng)物死亡。13.4.1.2低劑量組：根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定，可能引起或不引起遲發(fā)性神經(jīng)毒狀，其劑量一般為高劑量的五分之一至十分之一左右。13.4.1.3中劑量組：在高低之間，其癥狀在H級(jí)以上，少部分動(dòng)物可達(dá)W級(jí)（見13.6.1）。13.4.1.4陽(yáng)性對(duì)照組：500mg/kgTOCP（三鄰甲苯磷酸酯）。13.4.1.5空白對(duì)照：除不接觸試驗(yàn)農(nóng)藥外，其他各種條件與試驗(yàn)組相同。13.4.2給藥方式通常采用經(jīng)口途徑，包括灌胃、膠囊吞咽或咽峽部滴注等方法。13.4.3給藥前預(yù)處理隔夜禁食，經(jīng)口給藥前10min內(nèi)，所有試驗(yàn)雞均肌肉注射10mg/kg硫酸阿托品作保護(hù)處理。13.5試驗(yàn)期限13．5．1急性試驗(yàn)觀察期一般為21d。如未見異常反應(yīng)或有可疑反應(yīng)時(shí)，須再次給藥，繼續(xù)觀察21d。到期處死作組織病理學(xué)檢查。如特殊需要，部分動(dòng)物可延長(zhǎng)2~4周或更長(zhǎng)時(shí)間觀察恢復(fù)情況。13．5．2亞慢性試驗(yàn)連續(xù)給藥13周并觀察，停藥后再觀察一周。13．6臨床觀察和檢查13．6．1中毒癥狀給藥后每天觀察記錄試驗(yàn)雞的外觀體征，行為活動(dòng)，特別是雞的站立和運(yùn)動(dòng)姿勢(shì)及運(yùn)動(dòng)失調(diào)程度。必要時(shí)可強(qiáng)迫母雞活動(dòng)，如爬樓梯等，以便觀察遲發(fā)性神經(jīng)毒性的最小反應(yīng)。其典型癥狀的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：1步態(tài)稍異常；II步態(tài)嚴(yán)重異常；III能以跗站立；W不能站立。一般遲發(fā)性神經(jīng)毒性反應(yīng)在第7?10d開始出現(xiàn)并逐漸加重。每周稱體重一次。病理組織學(xué)檢查對(duì)死亡動(dòng)物和到期處死動(dòng)物檢查延髓/橋腦、大腦皮質(zhì)、小腦皮質(zhì)、脊髓（包括上位頸段、胸段中部、腰骶結(jié)合部和坐骨神經(jīng)等）并作組織切片。一般用灌流或其他方法，使被檢腦神經(jīng)組織固定在原來(lái)位置上。坐骨神經(jīng)切片要作髓鞘和軸索的特殊染色。光鏡觀察，必要時(shí)可作電鏡觀察檢查。13．7數(shù)據(jù)整理與結(jié)果評(píng)定將數(shù)據(jù)匯總列表，說(shuō)明每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)，有上述損傷或異常反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)，出現(xiàn)損傷和異常反應(yīng)的百分率，并用卡方等統(tǒng)計(jì)方法分析組間差異的顯著性。評(píng)定試驗(yàn)農(nóng)藥能否引起遲發(fā)性神經(jīng)毒性及其反應(yīng)。評(píng)定時(shí)應(yīng)結(jié)合所觀察到的神經(jīng)毒性效應(yīng)和神經(jīng)病理組織學(xué)檢查結(jié)果綜合考慮。14致突變?cè)囼?yàn)14．1目的檢測(cè)試驗(yàn)農(nóng)藥的誘變性。預(yù)測(cè)其遺傳危害和潛在致癌作用的可能性。14．2試驗(yàn)農(nóng)藥原藥。14.3鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)）14．3．1菌株本試驗(yàn)至少要用TA97、TA98、TA100和TA102四種標(biāo)準(zhǔn)突變型菌株。14.3.2試劑14.3.2.140%葡萄糖溶液：稱取400g葡萄糖，加入蒸鎦水稀釋至1000mL，在115℃（0.56kg/cm八2）10min高壓下滅菌。14.3.2.20.5mmol/L組氨酸-生物素溶液：D-生物素（分子量247.3）30.9mgL-組氨酸鹽酸鹽（分子量191.7）24.0mg蒸鎦水250mL14.3.2.3S-9混合液(按每毫升S-9混合液計(jì)算)：大鼠肝S-9100uLMgCl2-KCl鹽溶液20uL6-磷酸葡萄糖5umol輔酶H4umol0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)500muL無(wú)菌蒸鎦水380muL14.3.2.4鹽溶液［1.65mol/L氯化鉀(KC1)+0.4mol/L氯化鎂(MgCl2)］：氯化鉀(KC1)61.5g氯化鎂(MgCl2-6H2O)40.7g蒸鎦水500.0mL在121℃(15Ib)20min高壓下滅菌。14.3.2.50.2mol/L磷酸鹽緩沖劑(pH7.4)：磷酸二氫鈉(NaH2PO4-2H2O)0.593g磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)5.803g蒸鎦水100.0mL在121℃(1.05kg/cm八2)20min高壓下滅菌。14.3.2.60.15mol/L氯化鉀溶液：精確稱取氯化鉀11.18g,用蒸鎦水稀釋1000mL,121'C(1.05kg/cm八2)30min高壓下滅菌，冷卻后冰箱保存。14.3.2.7氨芐青霉素溶液(8mg/mL)：稱取三羥氨芐青霉素80mg,加入0.02mol/L氫氧化鈉溶液10mL。14.3.2.80.1%結(jié)晶紫溶液：稱取結(jié)晶紫10mg,力口10mL無(wú)菌水。14.3.2.9四環(huán)素溶液(8mg/mL)：稱取四環(huán)素40mg,加口入0.02mol/L鹽酸溶液5mL,用于四環(huán)素抗性試驗(yàn)。14.3.3培養(yǎng)基頂層培養(yǎng)基：瓊脂1.2g氯化物1.0g蒸鎦水200.0mL在121℃30min高壓滅菌后，加入0.5mmol/L組氨酸-生物素溶液20mL。底層培養(yǎng)基：瓊脂7.5g蒸鎦水465.0mL在121℃30min高壓滅菌后，加入(V-B)培養(yǎng)基E10mL和40%葡萄糖溶液25mL,混勻，按每皿30mL倒平皿，冷凝固化合倒置于37℃培養(yǎng)箱中24~48h。14.3.3.3Vogel-Bonner(V-B)培養(yǎng)基E：硫酸鎂(MgSO4-7H2O)10.0g檸檬酸(C6H8O7-H2O)100.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）500.0g磷酸二氫鈉（NaH2PO4-4H2O）175.0g先將檸檬酸、磷酸氫二鉀和磷酸二氫鈉溶解后，再加入硫酸鎂，待完全溶解后倒入容量瓶中，用蒸鎦水稀釋至1000mL,分裝于錐形瓶?jī)?nèi)，在121℃30min高壓下滅菌。14．3．3．4肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏2.5g胰胨5.0g氯化鈉（NaCl）2.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g蒸鎦水500.0mL在121℃30min高壓下消毒。14．3．3．5肉湯斜面或平板：瓊脂7.5g肉湯培養(yǎng)基500.0mL在121℃30min高壓滅菌后，倒斜面或平皿。用于菌株鑒定或常規(guī)試驗(yàn)用菌株保存。14．3．4溶劑和劑量分組常用溶劑為蒸鎦水、二甲基亞砜。此外還可用丙酮、二甲基甲酰胺、甲酰胺、95%乙醇等溶劑，最高加入量為0.1mL。試驗(yàn)農(nóng)藥的劑量范圍可在每皿0.1-5.0mg，或?qū)?xì)菌發(fā)生毒性的劑量之間。每種試驗(yàn)農(nóng)藥至少設(shè)三個(gè)劑量組，每個(gè)劑量至少三個(gè)重

復(fù)樣品。每次試驗(yàn)必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。14．3．5標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)陽(yáng)性誘變劑的反應(yīng)（見表9）。表9標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌株對(duì)陽(yáng)性誘變劑的回變反應(yīng)誘變劑劑量（ug）S-9TA97TA98TA100TA102柔毛霉素6.0--124312347592疊氨化鈉1.5--76330001882,4,7-三硝基-9-芴酮0.2--83778244400164-硝基O-次苯二胺20.0--2160159979804-硝基喹啉-N-氧化物0.5--5282924220287甲基磺酸甲酯1.0--17423273065862-氨基芴1.0+174261943026261苯并（a）芘1.0+33714393725514．3．6菌株準(zhǔn)備與鑒定14．3．6．1組氨酸的要求：將組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株分別接種于含有和不含有組氨酸的培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24h,觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。14.3.6.2脂多糖屏障缺陷：將含0.1mL試驗(yàn)菌株增菌液的頂層瓊脂培養(yǎng)液倒入肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，冷凝后，將無(wú)菌圓形濾紙片置于培養(yǎng)基中央，再滴上0.1%結(jié)晶紫溶液10mL,經(jīng)37℃培養(yǎng)24h。在紙片周圍有抑菌圈。即表示結(jié)晶紫分子已進(jìn)入菌體內(nèi)并抑制其生長(zhǎng)。14．3．6．3紫外線損傷修復(fù)缺陷：將被測(cè)菌株在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上劃線，然后用黑紙覆蓋一半，在15W的紫外燈下，距離33cm處照射8s,37℃培養(yǎng)24h后,TA97、TA98、TA100和TA102在沒有照射的那一半生長(zhǎng)，在照射的那一半不能生長(zhǎng)。3.6.4抗氨芐青霉素試驗(yàn)：將帶有R因子的菌株TA97、TA98、TA100和TA102在肉湯瓊脂培養(yǎng)基上劃線，然后把沾有氨芐青霉素溶液的濾紙條與劃線交叉，置37℃培養(yǎng)24h,觀察濾紙條周圍菌株生長(zhǎng)情況?？顾沫h(huán)素試驗(yàn)：將被測(cè)菌株增菌液在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上劃線，待干后，將四環(huán)素溶液與菌株劃線處交叉劃線，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后，對(duì)四環(huán)素有抗性的TA102菌株生長(zhǎng)不受抑制。自發(fā)回變：每種被測(cè)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變。TA97、TA98、TA100和TA102經(jīng)過(guò)體外代謝活化后，自發(fā)回變數(shù)要比不經(jīng)體外代謝活化的自發(fā)回變數(shù)略高。操作步驟板平板摻入法：向融化并保溫在45℃的2.0mL頂層培養(yǎng)基試管中依次加入試驗(yàn)農(nóng)藥、0.1mL增菌液0.5mLS-9混合液（或不加S-9混合液）混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，使其均勻分面，待上層培養(yǎng)基凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，37℃培養(yǎng)48h后，計(jì)數(shù)每皿回變菌落數(shù)。14．3．8結(jié)果評(píng)定試驗(yàn)農(nóng)藥的回變菌落數(shù)超過(guò)自發(fā)回變菌落數(shù)的兩倍以上，并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，則為陽(yáng)性。14．4小鼠骨髓多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)14．4．1試驗(yàn)動(dòng)物小鼠，體重為25?30g,每個(gè)劑量組至少雌雄各5只。14．4．2試驗(yàn)材料14.4.2.1姬姆薩染液：稱取Giemsa染料3.88，加入375mL分析純甲醇，待完全溶解后，再加入125mL甘油，放37℃恒溫箱中保溫48h,使其充分溶解，過(guò)濾，兩周后用。14.4.2.2磷酸鹽緩沖液（pH7.4）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4-12H2O）19.077g、磷酸二氫鉀（KH2P04）1.814g加蒸鎦水至1000mL。14.4.2.3Giemsa應(yīng)用液：取一份Giemsa液與六份磷酸鹽緩沖液混合而成。14.4.3劑量分組和給藥途徑一般取試驗(yàn)農(nóng)藥LD50的1/5、1/10、1/20和1/100等劑量，以觀察微核的劑量-反應(yīng)關(guān)系。同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（一般用環(huán)磷酰胺）。根據(jù)試驗(yàn)農(nóng)藥的水溶性或脂溶性來(lái)確定所用溶劑，常用水、植物油或吐溫-80等溶劑。給藥途徑視試驗(yàn)?zāi)康亩ǎ话阌媒?jīng)口灌胃或腹腔注射方式。采用30h給藥法，即兩次給藥間隔24h,第二次給藥后6h取材。14．4．4操作步驟14．4．4．1制片：斷延髓處死動(dòng)物，立即取出胸骨，除去胸骨上的血液和肌肉，橫向切斷胸骨，暴露骨髓腔，然后用小止血鉗擠出胸骨骨髓液。將骨髓液滴在載物片一端的胎牛血清液滴里，仔細(xì)混勻，按常規(guī)法涂片，在空氣中晾干。14.4.4.2固定：將骨髓涂片放入甲醇中固定15min,取出晾干。14.4.4.3染色：將骨髓片放入Giemsa應(yīng)用液中，染色15min,然后立即用pH7.4磷酸鹽沖液沖洗。