DB21T 3273-2020豬偽狂犬病毒野毒株與 gE 基因缺失疫苗株TaqMan 實時熒光定量 PCR 鑒別方法

ICS11.220遼寧省地DB21方標(biāo)準(zhǔn)DB21/T3273—2020ATaqManReal-timePCRMethodforDifferentiationofWild-typeStrainfromgE-deletedVaccineStrainofPseudorabiesVirus遼寧省市場監(jiān)督管理局發(fā)布 2 前言。標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心(沈陽市皇姑區(qū)寧山東路29號)，聯(lián)系電話：57試劑和材料本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬偽狂犬病毒(pseudorabiesvirus,PRV)野毒株及gE基因缺失毒株的TaqMan熒光PCR本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血液、組織臟器、精液、鼻腔拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物等材料中PRV核酸的檢測以及PRV本標(biāo)準(zhǔn)的實驗操作應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級實驗室(BSL-2實驗室)中進(jìn)行。性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GBT分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NYT541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范lycoproteinDlycoproteinEPRV偽狂犬病病毒(pseudorabiesvirus)儀器和耗材4.1儀器熒光PCR儀、高速冷凍離心機(可控溫至4℃，離心速度可達(dá)12000r/min以上)、組織研磨儀PCR~8℃普通冰箱、-20℃以下普通冰箱、-70℃以下超低溫冰箱、移液器(量程0.1μL~2μL、2μL~20μL、20μL~200μL)。4.2耗材5.1DNAzol?Reagent：商品化DNA提取試劑，2℃~8℃普通冰箱中保存；或商品化核酸提取試劑盒(如磁珠法核酸提取試劑)，通常18℃~25℃保存。5.375%乙醇：用無水乙醇和雙蒸水配制，-20℃普通冰箱中預(yù)冷。5.4PBS：磷酸鹽緩沖液(0.02mol/LpH7.2)，配制見附錄A。集、處理和運輸樣前準(zhǔn)備采樣人員采樣工具和器材樣品采集組織、三叉神經(jīng)節(jié)、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)等)或活體采集的扁桃體裝入滅菌的15mL~50mL離心管中，織臟器使用組織研磨儀或研缽進(jìn)行處理后用于核酸提取。mol/LpH7.2)中，編號備檢。品保存、包裝和廢棄物處理2加樣樣品運輸酸提取儀提取核酸提取試劑盒說明書提取。應(yīng)體系的配制和分裝冰盒中進(jìn)行；配制好的反應(yīng)液充分混勻后，按照每管18μL分裝于PCR反應(yīng)管內(nèi)，并做好制表2×TaqManFastqPCRMasterMix10μL上游特異性PCR引物(10μmol/L)0.5μL下游特異性PCR引物(10μmol/L)0.5μLTaqMan探針(10μmol/L)0.5μL滅菌雙蒸水6.5μLL1熒光通道gD和gE基因熒光qPCR反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃15s，60℃45s，收集熒光，40個循環(huán)。結(jié)果判定.1閾值設(shè)定質(zhì)量控制滿足，否則，本次實驗無效，需重新進(jìn)行。結(jié)果描述及判定8.3.1.1陰性RV8.3.1.2陽性8.3.1.3可疑Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進(jìn)行一次重復(fù)檢測。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為36＜Ct值≤38，且擴(kuò)增曲線均呈典型的S型擴(kuò)增曲線，報告為PRV核酸陽性，但需進(jìn)一步經(jīng)gE基因檢測來進(jìn)行PRV8.3.2.1陰性V8.3.2.2陽性8.3.2.3可疑Ct值≤38，判定為可疑，需從提取DNA開始進(jìn)行一次重復(fù)檢測。如重復(fù)檢測結(jié)果仍為36＜Ct值3鑒別方法則判定為PRV核酸陰性，既無PRV野毒也無疫苗毒。針對未免疫缺失gE基因的PRV疫苗(△gE/PRV)的豬如果gD基因或gE基因檢測結(jié)果為陽性，則判定為PRV野毒核酸陽性；如果gD基因和gE基因檢測均為(規(guī)范性附錄)A8mmol/LNaOH溶液的配制NaOHmLA.20.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制A.2.20.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.21g，先加適量去離子水溶(規(guī)范性附錄)序列(5’-3’)ACGAGGGCCAGTACCCAGGAATCGCATCAFAM-ACCAGCACCGCACGTACAAG-BHQ1ACGAGTTCAGCAATTCGTCACTTCCGFAM