實(shí)驗(yàn)二血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及

實(shí)驗(yàn)二血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜及定量測定

一、目的要求1、掌握722型分光光度計(jì)的使用。2、了解血紅蛋白及其衍生物的吸收光譜的測定。3、掌握血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

二、實(shí)驗(yàn)原理

血紅蛋白（Hb）與O2結(jié)合生成氧合血紅蛋白（HbO2），與CO結(jié)合生成一氧化碳血紅蛋白（HbCO），因其血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)不同，當(dāng)光線分別透過各種Hb溶液時(shí)，所吸收的光波也各異，可顯出特有的吸收光譜。這些吸收光譜可作為它們定性和定量分析的基礎(chǔ)，如HbO2在可見光波長400~600nm范圍內(nèi)有三個(gè)特征的吸收峰，其峰值分別在415、541和576nm處，當(dāng)氧合血紅蛋白轉(zhuǎn)為一氧化碳血紅蛋白（HbCO），此時(shí)光譜發(fā)生改變，在波長419、540和569nm處出現(xiàn)三個(gè)特征的吸收峰，其中在500~600nm范圍內(nèi)三個(gè)特征的吸收峰如下圖。

三、儀器和試劑

1．儀器：試管及試管架；吸量管；滴管和量筒；722型分光光度計(jì)；CO發(fā)生器。

2．試劑：

（1）濃H2SO4；（2）甲酸；（3）蒸餾水；

（4）血紅蛋白溶液。

722型分光光度計(jì)能在可見光譜區(qū)域內(nèi)對樣品物質(zhì)作定量的分析。該儀器廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床檢驗(yàn)、生物化學(xué)、石油化工、環(huán)境保護(hù)、質(zhì)量控制等部門，是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用分析儀器之一1、722型分光光度計(jì)的使用基本原理溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對光的吸收是具有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，因此當(dāng)某單色光通過溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律

操作方法

預(yù)熱儀器

選定波長

調(diào)節(jié)T=100％

固定靈敏度檔

調(diào)節(jié)“0”點(diǎn)

測定

關(guān)機(jī)注意事項(xiàng)

該儀器應(yīng)放在干燥房間內(nèi)，使用溫度為5℃~35℃。遠(yuǎn)離強(qiáng)電場、磁場

每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿

為了防止光電管疲勞。不測定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命

當(dāng)儀器停止工作時(shí)，切斷電源，電源開關(guān)同時(shí)切斷。并且用套子蓋住儀器，做好使用登記

四、實(shí)驗(yàn)步驟

1．樣品的制備：

用草酸鉀抗凝，取靜脈血，邊取邊輕輕搖動(dòng)，即制得全血。（1）氧合血紅蛋白（HbO2）液：加蒸餾水20ml，取全血0.1ml（3滴）盛于小燒杯中，混勻，此即HbO2液，呈鮮紅色。

（2）碳氧血紅蛋白（HbCO)液：

取上述HbO2液約5ml于試管中，通CO氣體（濃硫酸與甲酸在CO發(fā)生器中反應(yīng)發(fā)生）約10秒鐘，HbO2即變成櫻桃紅色的HbCO溶液。

2．吸光度測定及吸光光譜曲線的繪制：

（1）將如上制備的2種血紅蛋白液分別盛于比色杯內(nèi)，在722型分光光度計(jì)上以蒸餾水為空白調(diào)節(jié)吸光度零點(diǎn)和100%（每一次讀數(shù)均應(yīng)用空白管調(diào)節(jié)零點(diǎn)和100%）。（2）先從波長500~600nm分別測定HbO2，碳氧血紅蛋白的吸光度（在相應(yīng)峰值的10nm范圍內(nèi)每隔2nm記錄一次吸光度讀數(shù)，其余均每隔10nm記錄一次吸光度讀數(shù)）。（3）然后以吸光度為縱坐標(biāo)，波長為橫坐標(biāo)描點(diǎn)，并將各點(diǎn)連接成曲線，即為血紅蛋白及其衍生物