等電聚焦電泳課件

等電聚焦電泳背景介紹

等電聚焦電泳技術(shù)（isoelectricfocusing，IEF）是1980年慕尼黑工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)和化學(xué)分析研究所的RadolaBJ發(fā)展起來，并經(jīng)國外一些種子檢驗實驗室改進的一種非常實用的電泳技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個領(lǐng)域。該方法是利用蛋白質(zhì)具有兩性解離及等電點的特征，加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場內(nèi)經(jīng)過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。主要特點是：靈敏度及分辨率高、重復(fù)性好，特別適用于大批量純度檢測和真實性鑒定以及遺傳多樣性等群體生物學(xué)領(lǐng)域的研究。基本原理等電聚焦電泳(IEF)是利用兩性電解質(zhì)載體形成一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點的環(huán)境中則帶正電荷，向負極移動；若其處在高于其本身等電點的環(huán)境中，則帶負電向正極移動。當(dāng)泳動到其自身特有的等電點時，其凈電荷為零，泳動速度下降到零，具有不同等電點的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點位置，形成一個個清晰的區(qū)帶，分辨率極高。載體兩性電解質(zhì)pH梯度(carrierampholytepHgradient)等電聚焦，即在電場中通過兩性緩沖離子建立pH梯度。固相pH梯度(immobilizedpHgradients,IPG)等電聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定時，在滴定終點附近形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價聚合，形成固定的、不隨環(huán)境電場條件變化的pH梯度，分辨率可達0.001pH。載體兩性電解質(zhì)/固相pH梯度混合技術(shù)，即在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)作為添加劑，被稱為“雜交等電聚焦”。固相pH梯度等電聚焦與載體兩性電解質(zhì)等電聚焦的區(qū)別在于前者不是兩性分子，在凝膠聚合時便形成pH梯度.后者是兩性分子，在電場中兩性分子遷移到自己的等電點而形成pH梯度。IEF的分類pH梯度的形成等電聚焦也是在電場下進行的一種精密分離技術(shù)，但由于必須在電場的方向附加一個pH場，利用各溶質(zhì)遷移到pH等于其等電點的位置時便停止在那里而被分離。故技術(shù)的關(guān)鍵是如何形成穩(wěn)定的pH場以及減小對流、擴散、散熱以及電滲的影響。對于制備型的分離設(shè)備，解決以上諸問題的難度更大。多種建立pH梯度的方法：在電場下利用不同pH值緩沖溶液相互擴散，在混合區(qū)間形成pH梯度，稱人工pH梯度。但這種pH梯度易受緩沖溶液離子的遷移和擴散而變動，重復(fù)性差，已不被采用。利用溫度梯度建立pH梯度。因為溫度可以影響緩沖液的解離度，從而使pH值改變。由于每差別一個pH單位溫度約50℃，故這種方法只能建立范圍很窄的pH梯度，而且不易穩(wěn)定。固定化兩性載體和兩性緩沖液相結(jié)合。利用離子交換劑建立pH梯度。Sluyterma(1978)利用離子交換劑建立一個有pH梯度的柱進行等電聚焦，稱為色譜聚集。由外循環(huán)建立的pH梯度，Rilbe(1978)在兩電極室把溶液進行循環(huán)，以在電泳分離室中建立一個穩(wěn)定的pH梯度，稱為流動電解。緩沖液更新的方法。在電泳過程中，溶液的離子會產(chǎn)生電遷移。在兩個電極室中離子的消耗或積累，可由外部加和或取出加以平衡，以維持電泳池中緩沖液的組成和pH等流量泵不變。流動電解兩性介質(zhì)載體的選擇易溶于水，理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物質(zhì)不起化學(xué)反應(yīng)，也無變性作用。pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場作用下，自然形成pH梯度。電場下載體兩性電解質(zhì)的變化

在沒有電場時,載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷，只是在溶液中的正電荷和負電荷數(shù)目相等，凈電荷為零。引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動，最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移。(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì)，電負性最強,具有較強的緩沖氫離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì)，電正性最強，具有較強的緩沖氫氧根離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI，一直向陽極順延。pH梯度支持介質(zhì)常用的pH梯度支持介質(zhì)是凝膠，主要有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。循環(huán)流動等電聚焦示意圖循環(huán)等電聚焦這里表示了兩個流程。一個是用虛線連接的A、C室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到A、C室。消耗掉的電解質(zhì)由V補充。另一個流程是從A室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到C室，V＝0。為了防止對流作用，腔室厚度不宜超過5mm.目前多采用2mm或更小。等電聚焦電泳裝置分段固定化pH梯度裝置示意圖2.分段固定化pH梯度裝置A、B是固定化兩性電解質(zhì)段，C段為充滿載體液段，用一泵把液體循環(huán)。最后雜質(zhì)都收集到正、負極上，只余下等電點的蛋白質(zhì)在循環(huán)。利用這個設(shè)備可以處理大量液體和分離大量的蛋白質(zhì)，而且收率很高，存在的缺點是固定化兩性電解質(zhì)能夠水解，使pH場破壞。簡單操作步驟配膠：膠液組成為載體兩性電解質(zhì)，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質(zhì)等。灌膠：注意不要產(chǎn)生氣泡。冷卻2h后可接入電泳池。加電極液電泳樣品收集檢測等電聚焦電泳的優(yōu)缺點準(zhǔn)確度和精確度較高，操作簡單。IEF分離在較低的工作電壓下(20V/cm)進行，可以避免蛋白質(zhì)上專一結(jié)合（以共價鍵等強作用力結(jié)合，一定程度上依賴于蛋白質(zhì)的構(gòu)象)的金屬在電場作用下的丟失，這部分金屬大多構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性中心或結(jié)構(gòu)中心，比非專一結(jié)合金屬具有更重要的生物學(xué)意義。在樣品分離方面，載體兩性電解質(zhì)pH梯度的重現(xiàn)性仍然是難以解決的問題。選用固態(tài)pH梯度可以提高分辨率，加大上樣量，受到樣品中鹽的干擾小，無邊緣效應(yīng)，并有很好的重現(xiàn)性，這對建立微量元素種態(tài)分布數(shù)據(jù)庫這樣的工作是必需的．分辨率高。等電聚焦電泳屬于非變性蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，其分辨率至少可達0.01pH單位。pH梯度不穩(wěn)定現(xiàn)象IEF實驗技術(shù)不斷進步的同時，卻一直存在著pH值梯度不穩(wěn)定的現(xiàn)象，即存在著pH梯度的陰極和陽極漂移現(xiàn)象。陰極漂移是指在IEF實驗中pH梯度的堿性端逐漸消失的過程；反之，如果其酸性端逐漸消失則稱為陽極漂移。為了闡明IEF中pH值梯度不穩(wěn)定的機制，出現(xiàn)了各種假說：載體兩性電解質(zhì)向陰、陽極的等速電泳（ITP）遷移；在陰極因CO2的吸附而引