任務(wù)十四測(cè)定食品中毒素天然毒素和激素

任務(wù)十四測(cè)定食品中毒素天然毒素和激素1第1頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三項(xiàng)目一：測(cè)定貝類(lèi)食品中麻痹性貝類(lèi)毒素一、案例二、選用的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.213-2008貝類(lèi)中麻痹性貝類(lèi)毒素的測(cè)定。2第2頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、測(cè)定方法1．試樣制備（1）牡蠣、蛤、貽貝、扇貝等：用清水洗凈貝類(lèi)外殼，切斷閉殼肌，開(kāi)殼，用清水淋洗內(nèi)部，除去泥沙及其它外來(lái)雜質(zhì)，仔細(xì)取出貝肉，勿割破肉體，開(kāi)殼前不用麻醉劑或加熱。收集約200g肉瀝水5min，避免貝肉堆積，撿出碎殼等雜物，貝肉均質(zhì)。（2）冷凍貝類(lèi)：室溫下將樣品自然融化，其余操作同上。（3）貝類(lèi)罐頭：將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（包括貝肉和汁液）倒入均質(zhì)器中均質(zhì)，大容量罐頭可以過(guò)濾貝肉，分別稱(chēng)重，然后將固形物和汁液按比例混勻，充分均質(zhì)。（4）干貝類(lèi)：等體積0.18mol/L鹽酸溶液浸泡24～48h（4℃冷藏），按照上法瀝干，分別存放貝肉和酸液備用。3第3頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．保存樣品不能及時(shí)送檢，可以取200g樣品用200mL0.18mol/L鹽酸浸泡，4℃冷藏保存。3．麻痹性貝類(lèi)毒素(PSP)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照試驗(yàn)4第4頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4．試樣提?。?）將100g處理后樣品于800mL燒杯中，加0.18mol/LHCl溶液100mL，充分?jǐn)嚢瑁|(zhì)，調(diào)pH于2.0～4.0，需要時(shí)可以用5mol/LHCl或0.1mol/LNaOH逐滴滴加，并不斷攪拌，防止毒素破壞。（2）混合物加熱，徐徐煮沸5min，室溫冷卻后倒入200mL量筒中，調(diào)pH于2.0～4.0，pH勿大于4.5稀釋至200mL。（3）混合物倒回?zé)校瑪嚢杈鶆?，自然沉降至上清液半透明，不阻塞針頭為止，必要時(shí)可以用3000r/min離心上清液或混合物5min。5第5頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5．小鼠試驗(yàn)（1）取19.0～21.0g健康雄性小鼠6只，稱(chēng)重并記錄重量，分空白組和實(shí)驗(yàn)組，每組3只。（2）對(duì)每只實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射1mL提取液，注射時(shí)若有一滴以上提取液逸出，須將該小鼠丟棄，并重新注射1只小鼠。（3）記錄注射完畢時(shí)間，仔細(xì)觀察并用秒表記錄小鼠停止呼吸時(shí)的死亡時(shí)間（到小鼠呼出最后一口氣時(shí)）。（4）若小鼠死亡時(shí)間小于5min則要稀釋樣品提取液后，注射另一組3只小鼠，得到5～7min的死亡時(shí)間，稀釋提取液時(shí)，要逐滴加入0.1mol/L或0.01mol/LHCl，調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0。注射樣品后，有1只或2只小鼠的死亡時(shí)間大于7min，則需要注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力。6第6頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三6．結(jié)果計(jì)算與判斷（1）待測(cè)樣品校正鼠單位（CMU）確定：根據(jù)待測(cè)樣品的小鼠死亡時(shí)間，在表14-1PSP死亡時(shí)間-鼠單位的關(guān)系，查出相應(yīng)的鼠單位；再根據(jù)小鼠的質(zhì)量，在表14-2小鼠體重校正表中查出質(zhì)量校正系數(shù)，同一只小鼠的鼠單位（MU）與質(zhì)量校正系數(shù)之積，即該小鼠的CMU。受試組3只小鼠CMU的中位數(shù)受試組中位數(shù)。7第7頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）PSP的計(jì)算與結(jié)果陳述：①PSP結(jié)果計(jì)算：X=CMU1×CF×DF×200式中X——每100g樣品中PSP的含量，μg/100g；CMU1——檢測(cè)樣品受試組小鼠的中位數(shù)校正鼠單位CF——毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)；DF——稀釋倍數(shù)；200——樣品提取液體積，mL。②PSP毒力結(jié)果表述：若空白對(duì)照組小鼠正常，則報(bào)告待測(cè)樣品中PSP含量為：×××μg/100g。8第8頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（3）MU毒力的計(jì)算與結(jié)果陳述：①M(fèi)U毒力計(jì)算：Y=CMU1×DF×200Y——每100g樣品的MU值，MU/100g；其余同上式②MU毒力與結(jié)果表述：空白組正常情況下表述如下：若小鼠死亡時(shí)間大于60min，則待測(cè)樣品的鼠單位即小于0.875MU/g。若小鼠死亡時(shí)間小于5min，則應(yīng)對(duì)樣品提取液稀釋后，注射另一組3只小鼠，得到中位數(shù)死亡時(shí)間在5～7min為止，根據(jù)最后的稀釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算樣品的鼠單位毒力，報(bào)告該樣品的鼠單位為×××MU/100g。若實(shí)驗(yàn)組中位數(shù)死亡時(shí)間大于7min，則直接計(jì)算確定樣品鼠單位毒力，報(bào)告該樣品的鼠單位為×××MU/100g。若實(shí)驗(yàn)組中所有小鼠在15min內(nèi)無(wú)死亡，則報(bào)告該樣品鼠單位小于400MU/100g。9第9頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三7.試劑（1）0.18mol/L鹽酸：15mL濃鹽酸稀釋至1L。（2）5mol/L鹽酸：41.7mL濃鹽酸稀釋至100mL。（3）0.1mol/L氫氧化鈉溶液：4.0g氫氧化鈉溶于1L水。（4）PSP毒素（saxitoxin）標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/mL)：20%乙醇溶液，用5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0～4.0之間，用該液配制PSP標(biāo)準(zhǔn)溶液。（5）小鼠：體重在19～21g雄性小鼠。（6）蒸餾水（pH為3）：用鹽酸調(diào)。8．儀器（1）均質(zhì)器。（2）離心機(jī)。（3）天平。（4）注射器。（5）電爐。（6）秒表。（7）玻璃器皿。10第10頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、相關(guān)知識(shí)（一）貝類(lèi)中麻痹性貝類(lèi)毒素的測(cè)定——生物法原理根據(jù)小鼠注射貝類(lèi)提取液后死亡的時(shí)間，查出鼠單位，并按小鼠體重，查表校正鼠單位，計(jì)算確定每100g貝類(lèi)肉內(nèi)的PSP含量，所測(cè)結(jié)果代表存在于該貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的PSP總量。本法摘自GB/T5009.213-2008，適用于貝類(lèi)及其制品中PSP檢測(cè)。（二）注意事項(xiàng)1．鼠單位（MU）：對(duì)體重20g的雄性小鼠腹腔注射1mL麻痹性貝類(lèi)毒素提取液，使其在15min內(nèi)死亡所需最小毒素量。2．毒素對(duì)人體有害，應(yīng)該在有保護(hù)情況下進(jìn)行操作，所用玻璃實(shí)驗(yàn)室儀器應(yīng)該用5%次氯酸鈉溶液浸泡1h，使毒素分解；廢棄提取液也需用5%次氯酸鈉處理。3．PSP死亡時(shí)間與MU的關(guān)系表11第11頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五、測(cè)定食品中麻痹性貝類(lèi)毒素的方法（一）進(jìn)出口貝類(lèi)中麻痹性貝類(lèi)毒素檢測(cè)方法本法摘SN/T1773-2006酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測(cè)定貝類(lèi)中麻痹性貝類(lèi)毒素，適用于雙殼類(lèi)貝肉、貝柱和其他可食用部分麻痹性貝類(lèi)毒素的篩選檢測(cè)。（二）高效液相色譜法測(cè)定貝類(lèi)產(chǎn)品中麻痹性貝類(lèi)毒素本法摘自SN/T1735-2006進(jìn)出口貝類(lèi)產(chǎn)品中麻痹性貝類(lèi)毒素檢驗(yàn)方法，適用于貝類(lèi)產(chǎn)品中麻痹性貝類(lèi)毒素的檢驗(yàn)。12第12頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

項(xiàng)目二測(cè)定食品中的黃曲霉毒素一、案例二、選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009.22-2003食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定——薄層色譜法。13第13頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、測(cè)定方法1．取樣試樣中污染黃曲霉毒素B1高的霉粒一粒左右可以測(cè)定結(jié)果。由于有毒霉粒的比例小，且分布不均勻，為避免取樣帶來(lái)的誤差，應(yīng)大量取樣，并將該大量試樣粉碎，混合均勻，才有可能得到確能代表一批試樣的相對(duì)可靠的結(jié)果，因此采樣應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）根據(jù)規(guī)定采取有代表性試樣。（2）對(duì)局部發(fā)霉變質(zhì)的試樣檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)單獨(dú)取樣。（3）每份分析測(cè)定用的試樣應(yīng)從大樣經(jīng)粗碎與連續(xù)多次用四分法縮減至0.5～1kg，然后全部粉碎。14第14頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．提?。?）玉米、大米、麥類(lèi)、面粉、薯干、豆類(lèi)、花生、花生醬等。甲法：稱(chēng)取20.00g粉碎過(guò)篩試樣（面粉、花生醬不需粉碎），置于250mL具塞錐形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一層水，蓋嚴(yán)防漏。振蕩30min，靜置片刻，以疊成折疊式的快速定性濾紙過(guò)濾于分液漏斗中，待下層甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞錐形瓶?jī)?nèi)。取20.00mL甲醇水溶液（相當(dāng)于4g試樣）置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層，如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象可滴加甲醇促使分層。放出三氯甲烷層，經(jīng)盛有約10g預(yù)先用三氯甲烷潤(rùn)濕的無(wú)水硫酸鈉的定量慢速濾紙過(guò)濾于50mL蒸發(fā)皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重復(fù)振搖提取，三氯甲烷層一并濾于蒸發(fā)皿中，最后用少量洗過(guò)濾器，洗液并于蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿放在通風(fēng)柜于65℃水浴上通風(fēng)揮干，然后放在冰盒上冷卻2～3min后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液（或?qū)⑷燃淄橛脻饪s蒸餾器減壓吹氣蒸干后，準(zhǔn)確加入1mL苯-乙腈混合液）。用帶橡膠皮頭的滴定管的管尖將殘?jiān)浞只旌?，若有苯的結(jié)晶析出，將蒸發(fā)皿從冰盒上取出，繼續(xù)溶解、混合，晶體即消失，再用此滴管吸取上清液轉(zhuǎn)移于2mL具塞試管中。乙法（限于玉米、大米、小麥及其制品）：15第15頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）花生油、香油、菜油等：（3）醬油、醋。（4）干醬類(lèi)（包括豆豉、腐乳制品。（5）發(fā)酵酒類(lèi)：16第16頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3．測(cè)定（1）單向展開(kāi)法①薄層板的制備：稱(chēng)取約3g硅膠G，加相當(dāng)于硅膠量2～3倍左右的水，用力研磨1～2min至成糊狀后立即倒于涂布器內(nèi)，推成5cm×20cm，厚度約為0.25mm的薄層板三塊。在空氣中干燥約15min后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2天～3天，若放置時(shí)間較長(zhǎng)，可再活化后使用。17第17頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三②點(diǎn)樣：將薄層板邊緣附著的吸附劑刮凈，在距薄層板下端3cm的基線上用微量注射器或血色素吸管滴加樣液。一塊板可滴加4個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)距邊緣和點(diǎn)間距約為1cm，點(diǎn)直徑約為3mm。在同一塊板上滴加的大小應(yīng)一致，滴加時(shí)可用吹風(fēng)機(jī)用冷風(fēng)邊吹邊加。滴加樣式如下：第一點(diǎn)：10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）。第二點(diǎn)：20μL樣液。第三點(diǎn)：20μL樣液+10μL0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。第四點(diǎn)：20μL樣液+10μL0.2μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。18第18頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三③展開(kāi)與觀察：在展開(kāi)槽內(nèi)加10mL無(wú)水乙醚，預(yù)展12cm，取出揮干。再于另一展開(kāi)槽內(nèi)加10mL丙酮-三氯甲烷（8+92），展開(kāi)10～12cm，取出。在紫外光下觀察結(jié)果，方法如下。由于樣液點(diǎn)上加滴黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液，可使黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)與樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點(diǎn)重疊。如樣液為陰性，薄層板上的第三點(diǎn)中黃曲霉毒素B1為0.0004μg，可用作檢查在樣液內(nèi)黃曲霉毒素B1最低檢出量是否正常出現(xiàn)；如為陽(yáng)性，則起定性作用。薄層板上的第四點(diǎn)中黃曲霉毒素B1為0.002μg，主要起定位作用。若第二點(diǎn)在與黃曲霉素標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的相應(yīng)位置上無(wú)藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，表示試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下；如在相應(yīng)位置上有藍(lán)紫色熒光點(diǎn)，則需進(jìn)行確證試驗(yàn)。19第19頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三④確證試驗(yàn)：為了證實(shí)薄層板上樣液熒光系由黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的，加滴三氟乙酸，產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的衍生物，展開(kāi)后此衍生物的比移值約在0.1左右。于薄層板左邊依次滴加兩個(gè)點(diǎn)。第一點(diǎn)：0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL。第二點(diǎn)：20μL樣液。于以上兩點(diǎn)各加一小滴三氟乙酸蓋于其上，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min后，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃，再于薄層板上滴加以下兩個(gè)點(diǎn)。第三點(diǎn)：0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液10μL。第四點(diǎn)：20μL樣液。再展開(kāi)，在紫外光燈下觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)相同的衍生物。未加三氟乙酸的三四兩點(diǎn)，可依次作為樣液與標(biāo)準(zhǔn)的衍生物空白對(duì)照。20第20頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑤稀釋定量：樣液中的黃曲霉毒素B1熒光點(diǎn)的熒光強(qiáng)度如與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的最低檢出量（0.0004μg）的熒光強(qiáng)度一致，則試樣中黃曲霉毒素B1含量即為5μg/kg。如樣液中熒光強(qiáng)度比最低檢出量強(qiáng)，則根據(jù)其強(qiáng)度估計(jì)減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸龜?shù)，直至樣液點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與最低檢出量的熒光強(qiáng)度一致為止。滴加式樣如下：第一點(diǎn)：10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）。第二點(diǎn)：根據(jù)情況滴加10μL樣液。第三點(diǎn)：根據(jù)情況滴加15μL樣液。第四點(diǎn)：根據(jù)情況滴加20μL樣液。21第21頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（2）雙向展開(kāi)法滴加兩點(diǎn)法①點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板的距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL），在距左邊緣2.8～3cm處各滴加20μL樣液，然后在第二塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL），在第三塊板的樣液點(diǎn)上加滴10μL0.2μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液。②展開(kāi)：橫向展開(kāi)：在展開(kāi)槽內(nèi)的長(zhǎng)邊置一玻璃支架，加10mL無(wú)水乙醇，將上述點(diǎn)好的薄層板靠標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的長(zhǎng)邊置于展開(kāi)槽內(nèi)展開(kāi)，展至板端后，取出揮干，或根據(jù)情況需要時(shí)可再重復(fù)展開(kāi)1～2次?？v向展開(kāi)：揮干的薄層板以丙酮-三氯甲烷（8+92）展開(kāi)至10～12cm為止。丙酮與三氯甲烷的比例根據(jù)不同條件自行調(diào)節(jié)。22第22頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三③觀察及評(píng)定結(jié)果在紫外燈光下觀察第一、第二板，若第二板的第二點(diǎn)在黃曲霉毒素B1的相應(yīng)處出現(xiàn)最低檢出量，而第一板在與第二板的相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。若第一板在與第二板的相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板上第二點(diǎn)與第一板上的第二點(diǎn)的相同位置上的熒光點(diǎn)是否與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊，再進(jìn)行確證試驗(yàn)。在具體測(cè)定中，第一、二、三板可以同時(shí)做，也可按照順序做。如按順序做，當(dāng)在第一板出現(xiàn)陰性時(shí)，第三板可以省略，如第一板為陽(yáng)性，則第二板可以省略，直接作第三板。23第23頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三④確證試驗(yàn)另取薄層板兩塊，于第四、第五兩板距左邊緣0.8～1cm處各滴加10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸；在距左邊緣2.8～3cm處，于第四板滴加20μL樣液及1小滴三氟乙酸；于第五板滴加20μL樣液、10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）及1小滴三氟乙酸，反應(yīng)5min后，用吹風(fēng)機(jī)吹熱風(fēng)2min，使熱風(fēng)吹到薄層板上的溫度不高于40℃。再用雙向展開(kāi)法展開(kāi)后，觀察樣液是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物。觀察時(shí)，可將第一板作為樣液的衍生物空白板。如樣液黃曲霉毒素B1含量高時(shí)則將樣液稀釋后，按單向展開(kāi)法中確證試驗(yàn)的方法做確證試驗(yàn)。24第24頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三⑤稀釋定量如樣液黃曲霉毒素B1含量高時(shí)，按單向展開(kāi)法中稀釋定量操作。如黃曲霉毒素B1含量低，稀釋倍數(shù)小，在定量的縱向展開(kāi)板上仍有雜質(zhì)干擾，影響結(jié)果的判斷，可將樣液再做雙向展開(kāi)法測(cè)定，以確定含量。25第25頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三滴加一點(diǎn)法①點(diǎn)樣：取薄層板三塊，在距下端3cm基線上滴加黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液與樣液。即在三塊板距左邊緣0.8～1cm處各滴加20μL樣液，在第二板的點(diǎn)上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（0.04μg/mL）在第三板的點(diǎn)上加滴10μL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2μg/mL）。②展開(kāi)：同滴加兩點(diǎn)法的橫向展開(kāi)與縱向展開(kāi)。26第26頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三③觀察及評(píng)定結(jié)果：在紫外光燈下觀察第一、二板，如第二板出現(xiàn)最低檢出量的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，而第一板與其相同位置上未出現(xiàn)熒光點(diǎn)，試樣中黃曲霉毒素B1含量在5μg/kg以下。如第一板在與第二板黃曲霉毒素B1相同位置上出現(xiàn)熒光點(diǎn)，則將第一板與第三板比較，看第三板與第一板相同位置上的熒光點(diǎn)是否與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊，如果重疊再進(jìn)行以下確證試驗(yàn)。27第27頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三④確證試驗(yàn)：另取兩板，于距左邊緣0.8～1cm處，第四板滴加20μL樣液、1滴三氟乙酸；第五板滴加20μL樣液、10μL0.04μg/mL黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液及1滴三氟乙酸。產(chǎn)生衍生物及展開(kāi)方法同滴加兩點(diǎn)法中的“④確證試驗(yàn)”。再將以上二板在紫外光燈下觀察，以確定樣液點(diǎn)是否產(chǎn)生與黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重疊的衍生物，觀察時(shí)可將第一板作為樣液的衍生物空白板。經(jīng)過(guò)以上確證試驗(yàn)定為陽(yáng)性后，再進(jìn)行稀釋定量，如含黃曲霉毒素B1低，不需稀釋或稀釋倍數(shù)小，雜質(zhì)熒光仍有嚴(yán)重干擾，可根據(jù)樣液中黃曲霉毒素B1熒光的強(qiáng)度，直接用雙向展開(kāi)法定量。28第28頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4．結(jié)果計(jì)算：式中X——試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；V1——加入苯-乙腈混合液的體積，mL；V2——出現(xiàn)最低熒光時(shí)滴加樣液的體積，mL；D——樣液的總稀釋倍數(shù)；m——加入苯-乙腈混合液溶解時(shí)相當(dāng)試樣的質(zhì)量，g；0.0004——黃曲霉毒素B1的最低檢出量，μg。5．試劑三氯甲烷、正己烷或石油醚、甲醇、苯、乙腈、無(wú)水乙醚或乙醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水、丙酮、硅膠G、三氟乙酸、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉、苯-乙腈混合液、甲醇水溶液（55+45）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。6．儀器小型粉碎機(jī)、樣篩、電動(dòng)振蕩器、全玻璃濃縮器、玻璃板（5cm×20cm）、薄層板涂布器、展開(kāi)槽、紫外光燈、微量注射器或血色素吸管。29第29頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、相關(guān)知識(shí)食品中黃曲霉毒素B1測(cè)定——薄層色譜法原理試樣中黃曲霉毒素B1經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在波長(zhǎng)365nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，根據(jù)其在薄層上顯示熒光的最低檢出量來(lái)測(cè)定含量。本法摘自GB/T5009.22-2003，適用于糧食、花生及其制品、薯類(lèi)、豆類(lèi)、發(fā)酵食品及酒類(lèi)等各種食品中黃曲霉毒素B1的測(cè)定。本法黃曲霉毒素B1的最低檢出量為0.0004μg，檢出限為5μg/kg。五、測(cè)定食品中黃曲霉毒素的方法（一）食品黃曲霉毒素的限量（二）食品黃曲霉毒素測(cè)定方法測(cè)定食品中黃曲霉毒素的其它方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附劑法、高效液相色譜法、微柱篩選法等，出自GB/T5009.22-2003，GB/T5009.23-2003，GB/T5009.24-2003。1．酶聯(lián)免疫吸附劑法測(cè)定食品中黃曲霉毒素B1原理2．高效液相色譜法測(cè)定食品中黃曲霉毒素。。3．GB/T23212-2008《牛奶和奶粉中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2的測(cè)定》——液相色譜-熒光檢測(cè)法。30第30頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三項(xiàng)目三：測(cè)定食品中鹽酸克倫特羅的含量一、案例二、選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

GB/T5009.192-2003動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量的測(cè)定——高效液相色譜法。31第31頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、測(cè)定方法1．提?。?）肌肉、肝臟、腎臟試樣：稱(chēng)取肌肉、肝臟或腎臟試樣10g(精確0.01g)，用20mL0.1mol/L高氯酸溶液勻漿，置于磨口玻璃離心管中；然后置于超聲波清洗器中超聲20min，取出置于80℃水浴中加熱30min，取出冷卻后4500r/min離心15min。傾出上清液，沉淀用5mL0.1mol/L高氯酸溶液洗滌，再離心，將兩次的上清液合并。用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至9.5，若有沉淀產(chǎn)生，再以4500r/min離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至磨口玻璃離心管中，加人8g氯化鈉，混勻，加人25mL異丙醇+乙酸乙酯(40+60)，置于振蕩器上振蕩提取20min。提取完畢，放置5min(若有乳化層稍離心—下)。用吸管小心將上層有機(jī)相移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，用20mL異丙醇+乙酸乙酯(40+60)再重復(fù)萃取—次，合并有機(jī)相，于60℃在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至近干。用1mL0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)充分溶解殘留物，經(jīng)針筒式微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，洗滌三次后完全轉(zhuǎn)移至5mL玻璃離心管中，用0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)定容至刻度。（2）尿液試樣：（3）血液試樣：32第32頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三2．凈化依次用10mL乙醇、3mL水、3mL0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0)，3mL水沖洗弱陽(yáng)離子交換柱，取適量上述提取液至弱陽(yáng)離子交換柱上，棄去流出液，分別用4mL水和4mL乙醇沖洗柱子，棄去流出液，用6mL乙醇+濃氨水(98+2)沖洗柱子，收集流出液。將流出液在N2-蒸發(fā)器上濃縮至干。3．試樣測(cè)定前的準(zhǔn)備于凈化、吹干的試樣殘?jiān)屑尤?00～500μL流動(dòng)相，在渦漩式混合器上充分振搖，使殘?jiān)芙?，液體渾濁時(shí)用0.45μm的針筒式微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，上清液待進(jìn)行液相色譜測(cè)定。33第33頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三4．測(cè)定（1）液相色譜測(cè)定參考條件色譜柱：BDS或ODS柱，250mm×4.6mm，5μm。流動(dòng)相：甲醇+水(45+55)。流速：1mL/min。進(jìn)樣量：20～50μL。柱箱溫度：25℃。紫外檢測(cè)器：244nm。（2）測(cè)定吸取20～50μL標(biāo)準(zhǔn)校正溶液及試樣液注入液相色譜儀，以保留時(shí)間定性，用外標(biāo)法單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)法定量。34第34頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三5．結(jié)果計(jì)算式中X——試樣中克倫特羅的含量，μg/kg或μg/L；A——試樣色譜峰與標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的峰面積比值對(duì)應(yīng)的克倫特羅的質(zhì)量，ng；f——試樣稀釋倍數(shù)；m——試樣的取樣量，g或mL。6．試劑氯化鈉、高氯酸溶液(0.1mol/L)、氫氧化鈉溶液(1mol/L)、磷酸二氫鈉緩沖液(0.1mol/L，pH6.0)、異丙醇+乙酸乙酯(40+60)、乙醇+濃氨水(98+2)、甲醇+水(45+55)、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)溶液、弱陽(yáng)離子交換柱(LC-WCX)(3mL)。7．儀器水浴超聲清洗器、磨口玻璃離心管、5mL玻璃離心管、酸度計(jì)、離心機(jī)、振蕩器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、渦漩式混合器、針筒式微孔過(guò)濾膜(0.45μm，水相)、N2-蒸發(fā)器、勻漿器、高效液相色譜儀。35第35頁(yè)，共39頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、相關(guān)知識(shí)動(dòng)物性食品中克倫特羅殘留量測(cè)定——高效液相色譜法原理。固體試樣剪碎，用高氯酸溶液勻漿，液體試樣加入高氯酸溶液，進(jìn)行超聲加熱提取后，用異丙醇+乙酸乙醋(