分子生物學第二章DNA結構

分子生物學第二章DNA結構第1頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

第一節(jié)遺傳物質的本質第二節(jié)核酸的化學組成第三節(jié)DNA的二級結構第四節(jié)DNA的物理化學性質第五節(jié)超螺旋和拓撲異構第2頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四第一節(jié)遺傳物質的本質第3頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

a、編碼蛋白質和RNA的信息(編碼tRNA、rRNA)

64個三聯(lián)體密碼子3個終止密碼子編碼氨基酸的61個密碼子有簡并性、通用性一、DNA攜帶兩類不同的遺傳信息第4頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

b、編碼基因選擇性表達的信息基因選擇性表達表現(xiàn)在：細胞周期的不同時相中個體發(fā)育不同階段不同的器官和組織不同的外界環(huán)境下基因的表達與否以及量的差異第5頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

*原核生物的結構基因占Genome的比例很大

Φx174phage5386bp結構基因用去5169bp比例達96％*真核生物的結構基因占Genome的比例很小

哺乳動物中結構基因只占10％～15％第6頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四其余80％以上的DNA起什么作用目前還無法精確解釋，但可以肯定其中大部分DNA序列是編碼基因選擇性表達的遺傳信息

所以又稱－－調控序列第7頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四二、RNA也可作為遺傳物質

*RNA病毒傳染媒介是病毒顆粒（病毒基因組RNA、蛋白質外殼）如:煙草花葉病毒（TobaccoMosaicVirus，TMV)*類病毒（viroid）:使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子分子結構：含246~375個核苷酸的單鏈環(huán)狀RNA分子，沒有蛋白質外殼。專性活細胞內寄生。第8頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四三、是否存在核酸以外的遺傳物質

Prion(proteinaccousinfectionsparticle)朊病毒－－－蛋白質樣的感染因子羊搔癢病(scripie)人類庫魯（

kuru）病牛海綿狀腦炎(瘋牛病)…

均由傳染性病原蛋白顆粒引起統(tǒng)稱Prion(朊病毒)

Prion

復制?轉錄?翻譯?

第9頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四疾病癥狀發(fā)病機理發(fā)現(xiàn)病例庫魯病（Kuru）共濟失調、繼發(fā)癡呆通過同類相食（人）傳染約2600例醫(yī)源性克雅氏病(iCJD）癡呆，共濟失調通過朊病毒污染的HGH，或通過角膜移植約80例家族性克雅氏病同上PrP基因種系突變約100個家族零星發(fā)生克雅氏病同上體細胞突變PrPc自發(fā)轉變?yōu)镻rPsc？每年發(fā)生率約百萬分之一克雅氏病新突變體vCJD共濟失調，常伴有癡呆牛朊病毒傳染？46例GS綜合癥（GSS）共濟失調，常伴有癡呆PrP基因種系突變約50個家族致死性家族失眠癥（FFI）睡眠隔離，接著失眠，癡呆PrP基因種系突變（D178N和M129）9個家族

人類朊病毒疾病、癥狀及發(fā)病機理

第10頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性退化病理表現(xiàn)：大腦皮層的神經(jīng)原細胞退化、空泡變性、死亡、消失，最終被星狀細胞取代，因而造成海棉狀態(tài)第11頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四朊病毒帶來了諾貝爾生理/醫(yī)學獎

1997

StanleyB.Prusiner發(fā)現(xiàn)朊病毒是作為老年性癡呆癥等疾病的病原并能在寄主細胞中繁殖傳播第12頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)核酸的化學組成第13頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四嘧啶Pyrimidines嘌呤Purines

一、堿基、核苷、核苷酸☉堿基NitrogenousbasesUracil(U)第14頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四☉核苷（nucleotide）糖苷鍵Glycosidicbond嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子核糖是戊糖RNA－核糖核苷

DNA－脫氧核糖核苷第15頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四1’9☉核苷酸（nucleotideacid）核苷的磷酸酯脫氧核糖核苷酸核糖核苷酸其中α和β、β和γ之間是高能磷酸鍵αβγdNTP第16頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四堿基＋戊糖＝核苷核苷＋磷酸＝核苷酸核糖核苷三磷酸縮寫為NTP第17頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

二、DNA分子的一級結構

(DNAsequence)1、多聚核苷酸鏈

主鏈是核糖和磷酸側鏈為堿基由3’,5’磷酸二酯鍵連接2、鏈的方向：同一個磷酸基的3’酯鍵到5’酯鍵的方向

(5’→3’)5’-UCAGGCUA-3’=UCAGGCUA

默認書寫順序5‘→3’3’5’第18頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)DNA的二級結構第19頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四*1953.Watsosn&Crick

右手B-DNADoublehelixModel

一、DNA雙螺旋模型的提出（doublehelixmodel）第20頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

每一單鏈具有

5‘3’極性兩條單鏈極性相反反向平行兩條單鏈間以氫鍵連接以中心為軸，向右盤旋（直徑2nm）雙螺旋中存在大，小溝

*雙螺旋的主鏈第21頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四磷酸二酯鏈(PhosphodiesterBackbone)第22頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四C-GT-A

堿基互補第23頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四·直徑20?

*雙螺旋模型參數(shù)·螺距為34?（任一條鏈繞軸一周所升降的距離）·每圈有10個核苷酸（堿基）·有大溝和小溝配對堿基并不充滿雙螺旋空間，且堿基對占據(jù)的空間不對稱

·兩個堿基之間的垂直距離是3.4?。螺旋轉角是36度第24頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四Pitch34?Rise3.4?Width20?MajorGrooveMinorGroove10.4bp/turn第25頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四Twist36°第26頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四?大、小溝的差異⊕大溝中堿基差異容易識別，往往是蛋白質因子結合特異DAN序列的位點⊕小溝相對體現(xiàn)的信息較少第27頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四二、影響雙螺旋結構穩(wěn)定性的因素

l

氫鍵

(Hydrogenbond4~6kc/mol)

消除DNA單鏈上磷酸基團間的靜電斥力

弱鍵,可加熱解鏈氫鍵堆積,有序排列(線性,方向)

l

磷酸酯鍵(phosphoesterbond80~90kc/mol)l

0.2mol/LNa+

生理鹽條件

強鍵,需酶促解鏈

*維持穩(wěn)定性的因素第28頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四l

堿基堆積力(非特異性結合力)

(1kc/mol—0.6kc/mol)×n

☆

范德華力（Vandewaalsforce）

(1.7A°/嘌呤環(huán)與嘧啶環(huán)作用半徑)(0.34nm/堿基對間距)3.4A°第29頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

不溶于水的非極性分子在水中相互聯(lián)合,成串結合的趨勢力.(磷酸骨架,氨基,酮基周圍水分子間的有序排列

)l

磷酸基團間的靜電斥力

堿基內能增加(溫度),使氫鍵因堿基排列有序狀態(tài)的破壞而減弱

*不穩(wěn)定因素第30頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四三、雙螺旋結構的基本形式

·B-DNA資料來自相對濕度為92％所得到的DNA鈉鹽纖維·

此外人們還發(fā)現(xiàn)了A、C、D、E等右手雙螺旋和左手雙螺旋

Z構象等形式DNA結構的多態(tài)性：幾種不同的DNA雙螺旋結構以及同一種雙螺旋結構內參數(shù)存在差異的現(xiàn)象原因：多核苷酸鏈的骨架含有許多可轉動的單鍵磷酸二酯鍵的兩個P-O鍵、糖苷鍵、戊糖環(huán)各個鍵第31頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四ABZHandednessBaseInclination第32頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四ABZ大溝寬小溝窄小溝窄大溝變深小溝寬淺大溝不存在小溝窄而深第33頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四1、反向重復序列與二級結構

反向重復序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeatsIR）又稱回文序列（廻文）：指兩段同樣的核苷酸序列同時存在于一個分子中，但具有相反的方向有時也有不完全相同的情況RNA和DNA中都可能存在

此外還可有directedrepeatitivesequence---正向重復序列四、一些DNA序列的不尋常結構第34頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四C第35頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四反向重復序列間間隔較短或無間隔反向重復序列間間隔較長第36頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

*較短的回文序列可能是作為一種信號

如：限制性內切酶的識別位點一些調控蛋白的識別位點

例如限制性內切酶EcoRⅠ的識別位點

5‘－－GAATTC－－3’3‘－－CTTAAG－－5’第37頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

（1）形成條件

一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈如：polyA/polyUpolydA/polydTpolyd(AG)/polyd(CT)2、三螺旋DNA(TribleHelixDNA,T.SDNA)

可能與基因調控區(qū)域的功能和染色體重組有關第38頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAA

PolyT/A

TTTTTTTTTTT

AAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTAAAAAAAAAAD.S.DNA+D.S.DNAT.S.

DNA+

S.S.

DNA

（2）組成形式第39頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

b、

分子組成

☆

PY/PU+PU(偏堿性介質中穩(wěn)定)G＊G、A＊A、

G＊A＋

☆PY/PU+PY(偏酸性介質中穩(wěn)定)常見類型

G＊C＋

A＊T第三條鏈位于B-DNA的

Majorgroove中H-DNA

兩種異構體第40頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

T.S.DNA的連接鍵

Watsonbonding

A＝TG≡C(D.S.DNA)H+Hoogsteen氫鍵G＝C+(質子化)(第三鏈,pH小于7)第41頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四三股螺旋DNA結構特點總結第三條單鏈DNA分子位于B-DNA大溝內

與B-DNA以Hoogsteen鍵連接AT,GC兩氫鍵配對，C必需質子化

poly(Py):(Pu):(Py)為常見類型TriblehelixMajorgroovePy:Pu:Py3ed*可能功能可能與基因調控區(qū)域的功能和染色體重組有關第42頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四3、四股螺旋DNA

(tetraplexDNA,TetrableHelixDNA)

均有形成四股螺旋DNA的可能

5’---TTAGGGTTAGGGTTAGGG-3’3’---AATCCCAATCCC-5’

Poly(G)

染色體端粒高度重復的DNA序列形成條件－－串聯(lián)重復的鳥苷酸已有實驗結果表明－－真核細胞端粒中存在四鏈結構

第43頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四結構特點堿基之間靠Hoogsteen鍵連接GGGG基本結構單元－－鳥嘌呤四聯(lián)體第44頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四可能的功能

A、穩(wěn)定真核生物染色體結構

B、保證DNA末端準確復制

C、與DNA分子的組裝有關

D、與染色體的meiosis&mitosis有關

HoogsteenBonding

5’-----TTAGGGTTAGGGTTAGGGT

3’-----AATCCCAATCCC

GGG

TA第45頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四第46頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

第四節(jié)DNA的物理、化學性質第47頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

DNA雙股鏈的互補是其結構和功能上的一個基本特征也是DNA研究中一些實驗技術的基礎第48頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四一、DNA分子的變性

變性（denaturation或融解melting）：DNA雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，使雙螺旋的兩條鏈完全分開變成單鏈，這一雙鏈分離的過程叫做變性1、條件：加熱,極端pH,有機溶劑（尿素、酰胺)，低鹽濃度等

2、變性過程的表現(xiàn)

¤

是一個爆發(fā)式的協(xié)同過程，變性作用發(fā)生在一個很窄的溫度范圍

¤導致一些理化性質發(fā)生劇烈變化第49頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

表現(xiàn)為：

※熔液黏度降低

※沉降速度加大

※浮力密度上升

※此外吸收值升高（A260nm），即增色效應指在DNA變性的過程中，他在260nm的吸收值先是緩慢上升，達到某一溫度時及驟然上升

天然DNA和變性DNA的吸收值相差可達34％D.SDNAA260=1.0S.SDNAA260=1.37dNTPsA260=1.60

當濃度為50μg/ml時：第50頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四1.1851.01.37OD℃

Tm

=OD增加值的中點溫度(一般為85-95℃)或DNA雙螺旋結構失去一半時的溫度3、熔解曲線與融解溫度(Tm值)

緩慢而均勻地增加DNA

溶液的溫度（現(xiàn)可做到

0.1℃／分）可根據(jù)各點的A260值繪制成DNA

的熔解曲線

這也是一般PCR實驗技術中把變性溫度定為94℃的原因第51頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四1、影響Tm值的因素

（1）在A,T,C,G隨機分布的情況下，決定于GC含量（2）GC%含量相同的情況下GC%愈高→Tm值愈大GC%愈低→Tm值愈小

AT形成變性核心，變性加快，Tm值小

堿基排列對Tm值具有明顯影響5`GC3`CGn＞＞5`CG3`GCn5`TA3`ATn＜＜5`AT3`TAn36.7℃57.02℃

Tm136.12℃72.55℃

第52頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

※

嘌呤嘧啶的排列順序對雙螺旋結構（穩(wěn)定性）的影響

即－－氫鍵數(shù)目相同，但相鄰堿基的堆積力不同

從嘌呤到嘧啶方向的堿基堆積力作用顯著地大于同樣組成的嘧啶到嘌呤方向的堿基堆積作用Pyrimidine-PurineStepsHaveLittleBaseStacking5’3’3’5’CGAT5’CA3’3’GT5’第53頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四Purine-PyrimidineStepsHaveExtensiveBaseStacking5’3’3’CATG5’5’AC3’3’TG5’第54頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四生物體內僅UAA為最有效的終止密碼子

因為：UAAAUU

的Tm值是最低的一個，即使生理溫度下也不穩(wěn)定第55頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四（3）大片段D.SDNA分子之間比較片段長短對Tm值的影響較小,與組成和排列相關（4）小于100bp的D.SDNA分子比較片段愈短，變性愈快，Tm值愈?。?）變性液中含有尿素，甲酰胺等尿素，甲酰胺與堿基間形成氫鍵改變堿基對間的氫鍵

Tm值可降至40℃左右

（6）鹽濃度的影響

每升0.18molNa+是常用的標準條件

思考題：室溫下蒸餾水中的DNA會如何？第56頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四pH~12酮基→烯醇基pH~2-3NH2→NH2+(質子化)

改變氫鍵的形成與結合力（7）極端pH條件的影響一切減弱氫鍵，堿基堆積力的因素均將使Tm

值降低第57頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四2、常用的變性方法☆熱變性☆堿變性應用廣泛，特別是用于變性動力學研究缺點：高溫引起磷酸二酯鍵的斷裂，得到長短不一的單鏈pH11.3時，全部氫鍵被淘汰無熱變性的缺點，為制備單鏈DNA的首選方法

◎保存單鏈DNA的條件

保持pH大于11.3

鹽濃度低于0.01mol/L第58頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四D.SDNAS.SDNADenaturation▲▼Renaturation

復性過程依賴于單鏈分子間的隨機碰撞

(DependsonthecollisionofcomplementaryS.S.DNA)

二、DNA分子的復性（annealorrenaturation）

概念：變性DNA在適當條件下，兩條彼此分開的鏈又可以重新地合成雙螺旋結構的過程（退火）第59頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

1、影響DNA復性過程的因素：

陽離子濃度0.18~0.2MNa+

可消除polydNTP間的靜電斥力

復性反應的溫度低于Tm值25℃左右(60-65℃)

S.S,DNA的初始濃度C0

DNA分子中,堿基的排列狀況(隨機排列,重復排列)

S.S.DNA分子的長度（片段的大?。㏒.S.DNA愈長S.S.DNA愈短→分子擴散愈慢→復性愈慢→分子擴散愈快→復性愈快第60頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四3’-ATCTATGCTGTCAT-5’5‘-TAGATACGACAGTA-3’5‘-TAGATACGACAGTA-3’3’-ATCTATGCTGTCAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’5‘-TATATATATATA-3’3’-ATATATATATAT-5’3’-ATATATATATAT-5’5‘-TATATATATATA-3’第61頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四二、C0t曲線－－復性發(fā)生過程的討論dCt/dt=KC02

反應初始t=0單鏈DNA的隨機碰撞過程（randomlycollision

）單鏈DNA濃度=C0反應達t時單鏈DNA濃度=CtK＝復性速度常數(shù)包括兩個因素：DNA的濃度（C，mol/L）和時間(s)第62頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四dCt/dt=KC02積分Ct/C0=1/(1+KC0t)當Ct/C0=1/2

時Ct/C0=1/2=1/(1+KC0t(1/2))K=1/Cot(1/2)Cot(1/2)

=1/K(mol.Sec/L)

常數(shù)

第63頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四Ct/C0是C0t的函數(shù)按此公式作圖得C0t曲線Ct/C0

01C0t(1/2)C0t第64頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四基因組的復雜性＝單一序列的長度＋重復序列的長度復雜性的單位為核苷酸的數(shù)目例如：含單一序列a,b,c,d復雜性＝a+b+c+d復雜性＝分子量含106a,103b,10c,d復雜性＝a+b+c+d復雜性＜＜分子量基因組的復雜性(genomiccomplexity)第65頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四復雜性

*C0t和DNA的復雜性間存在線性關系：themorecomplexaDNA,thehigheritsCot(1/2)

1:10－62×105:0.42×109:4000第66頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四A"typical"mammalianC0tcurvehasthreeplateaus*C0t曲線能解釋單一來源的DNA所具有的不同復雜性部分真核生物的基因組由高度重復（highlyrepetitive)序列、中度重復（moderatelyrepetitiveormid-repetitive)序列單一（singlecopy)序列組成第67頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四四、富含A－T序列和DNA雙螺旋結構的呼吸作用●

高等生物染色體的某一區(qū)段，A·T含量變化很大

很多有重要調節(jié)功能的的DNA區(qū)段都富含A·T

（原核、真核－－復制起點、啟動子、終止子等區(qū)域）●

DNA雙螺旋結構的呼吸作用：DNA雙螺旋結構內部，配對堿基的氫鍵的迅速斷裂和再生的過程●

DNA內富含A·T區(qū)段呼吸作用尤為明顯

這對于某些特殊的蛋白質與DNA發(fā)生反應并閱讀鏈內部的信息具有重要作用第68頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四第五節(jié)超螺旋和拓撲異構第69頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四一、超螺旋（superhelixORsupercoil）●

最早在SV40和多瘤病毒中發(fā)現(xiàn)●超螺旋是所有線性或環(huán)形DNA的共有的重要特征ThesupercoilsoftheSV40minichromosomecanberelaxedtogenerateacircularstructure,whoselossofhistonesthengeneratessupercoilsinthefreeDNA.第70頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四1、超螺旋結構的方向性B-DNA緊纏overwinding(右旋)

正超螺旋（positivesupercoiled）導致左手超螺旋以一根繩子做實驗：原來的繩子的兩股以右旋方向纏繞；在繩子的一端向緊纏方向捻轉，再將繩子的兩端連接起來，則產(chǎn)生一個左旋的超螺旋以解除外加捻轉的協(xié)變第71頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四B-DNA松纏unwinding(左旋)

負超螺旋（NegativeSupercoiled

）導致右手超螺旋在繩子的一端向松纏方向捻轉，再將繩子的兩端連接起來，則產(chǎn)生一個右旋的超螺旋以解除外加捻轉的協(xié)變第72頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四超螺旋的形成總是要向著抵消初級螺旋改變的方向發(fā)展所有生物的DNA幾乎有5%為NegativeSuperhelix

二、超螺旋狀態(tài)的描述1、可用數(shù)學公式描述Vinograd方程式L=T+W(α=β+γ)第73頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四L

連接數(shù)（Linkingnumber）

雙鏈DNA的交叉數(shù)，不發(fā)生鏈斷裂時，L為定值T

盤繞數(shù)（Twistingnumber）雙鏈DNA的纏繞數(shù)，初級螺旋圈數(shù)W超盤繞數(shù)（Writhingnumber）直觀上為雙螺旋在空間的轉動數(shù)W=負值（negativesuperhelix）W=正值(positivesuperhelix）

第74頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四420bp*B-DNA是力學上穩(wěn)定的結構(10bp/helix)*

螺旋數(shù)改變的結果之一是產(chǎn)生超螺旋

或是在B_DNA中保留一單鏈區(qū)域，但須能量的功給第75頁，共81頁，2023年，2月20日，星期四

＊

DNA在水溶液中,構型偏B型狀態(tài)＊

DNA以10.5bp/helix為最穩(wěn)定構型＊

小于10.5bp/helix向正超螺旋發(fā)展(緊縮態(tài))＊

大于10.5bp/helix向負超螺旋發(fā)展(松弛態(tài))

天然的DNA都是負超螺旋