蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)(學(xué)時(shí))

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

（structureofprotein）

為研究的方便，可將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為兩類(lèi)：初級(jí)結(jié)構(gòu)（primarystructure）:即一級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的最基本結(jié)構(gòu)；高級(jí)結(jié)構(gòu)（advancedstructure）又稱(chēng)為三維結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)、構(gòu)象二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondarystructure）三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)初級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系:一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五第3節(jié)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

（primarystructureofproteins）

1蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念（conceptofproteins’primarystructure）2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的例子—胰島素（insulin）3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定4蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系5肽與蛋白質(zhì)的人工合成（自學(xué)）現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的概念

（conceptofproteins’primarystructure)）

蛋白質(zhì)的一結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸的排列順序。在基因編碼的蛋白質(zhì)中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的即DNA分子中核苷酸的序列決定的。蛋白質(zhì)的一結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu)。其表示方法與多肽相同：從左到右，從N-末端寫(xiě)到C-末端，寫(xiě)出組成多肽鏈的氨基酸的三個(gè)字母或單個(gè)字母的簡(jiǎn)寫(xiě)符號(hào)，氨基酸殘基之間用“-”或“·”連接?，F(xiàn)在是3頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五多肽鏈中氨基酸之間的連接鍵主要是肽鍵（peptidebonde），另外有的還有二硫鍵(disulfidebond)，有鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵之分。二硫鍵起著穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)的作用，二硫鍵越多越稱(chēng)穩(wěn)定，而且往往與生物活性有關(guān)。現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五鏈間二硫鍵、鏈內(nèi)二硫鍵現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五2蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的例子—胰島素（insulin）胰島素是動(dòng)物胰臟中胰島β細(xì)胞分泌的一種分子量較小（5700）的激素蛋白質(zhì)；其主要功能是促進(jìn)糖原的合成和加速葡萄糖的氧化，從而使體內(nèi)血糖濃度降低，即低血糖效應(yīng)。現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五分泌不足時(shí)，組織中的糖利用發(fā)生障礙，肝糖原分解加速，并從尿中排而患糖尿病，因此，臨床上胰島素可用來(lái)治療糖尿病。胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由英國(guó)的Sanger(桑格)等于1953年首先完成的，花費(fèi)了10年時(shí)間，這是蛋白質(zhì)化學(xué)研究史上一項(xiàng)重大成就?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530SS—S————S——SS現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1）胰島素由A、B二條鏈組成，A鏈21個(gè)氨基酸殘基（含4個(gè)Cys），B鏈30個(gè)氨基酸殘基(含2個(gè)Cys)2）有3個(gè)二硫鍵：A6-A11（鏈內(nèi)）；A7-B7；A20-B19（鏈間）3）沒(méi)有Trp,Met，（Asp都以Asn形式存在，共有17種氨基酸）現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)研究的意義a.使人們從根本上認(rèn)識(shí)由于20種氨基酸的排列順序不同而組成不同的蛋白，并具有各種不同的生物學(xué)功能。b.許多先天性疾病是由于某一種重要的蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而引起的，所以測(cè)定蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)有助于臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)疾病的診斷。c.因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的排列順序是由遺傳密碼所決定的，氨基酸的改變最根本的原因是DNA上的核苷酸順序發(fā)生改變所致，研究蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)可以從分子水平上診斷和治療遺傳病。現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五核糖核酸酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定（主要內(nèi)容）3.1一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的一般步驟(或策略)3.2幾個(gè)重要的測(cè)定步驟3.3蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.1一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的一般步驟(或策略)

1）測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；2）拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈；3）斷開(kāi)多肽鏈內(nèi)的二硫鍵；4）分析測(cè)定每一多肽鏈的氨基酸組成（aminoacidcomposition）；5）鑒定多肽鏈的N-末端和C-末端的氨基酸；現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五6）裂解多肽鏈成較小片段；7）測(cè)定各肽段的氨基酸序列；8）確定肽段在多肽鏈中的次序，即重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)；9）確定多肽鏈中二硫鍵的位置?，F(xiàn)在是15頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2幾個(gè)重要的測(cè)定步驟（內(nèi)容）3.2.1肽鏈末端的測(cè)定:N-末端;C-末端3.2.2肽鏈的拆開(kāi)和分離(-S-S-的斷裂)3.2.3氨基酸組成的分析測(cè)定3.2.4肽鏈的部分裂解:化學(xué)法,酶法3.2.5肽段氨基酸序列的測(cè)定3.2.6肽段在多肽鏈中次序的確定3.2.7二硫鍵位置的確定現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.1肽鏈末端的測(cè)定:N-末端;C-末端1）N-末端分析①二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法②丹磺酰氯(DNS)法③苯異硫氰酸酯(PITC,或Edman降解)法④氨肽酶（aminopeptidase）法2）C-末端分析①肼解法②還原法③羧肽酶法現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五①二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法多肽鏈的游離NH2與DNFB(又稱(chēng)為Sanger試劑)反應(yīng)后，生成DNP-多肽，酸水解生成DNP-氨基酸衍生物和其它游離氨基酸，DNP-氨基酸為黃色，然后用有機(jī)溶劑(如已酸已酯)抽提出來(lái)，用紙層析、薄層層析或高效液相層析法(HPLC)進(jìn)行定性、定量測(cè)定?，F(xiàn)在是18頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五②丹磺酰氯(DNS)法該法原理與DNFB相同，只是將DNS代替DNFB試劑；DNS具有強(qiáng)烈的熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不需要提取，可直接用紙電泳或薄層層析或熒光光度計(jì)檢測(cè)?，F(xiàn)在是19頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五苯異硫氰酸酯(PITC，或Edman降解)法PITC（Edman試劑）與多肽的氨基端反應(yīng)生成PTC-多肽，在酸性有機(jī)溶劑中加熱時(shí)生成PTH-氨基酸和少一個(gè)氨基酸的多肽，（PTC基只使第一個(gè)肽鍵的穩(wěn)定性下降），然后用有機(jī)溶劑抽提干燥后，用薄層層析、氣相色譜或HPLC等分析鑒定。該法也可用業(yè)測(cè)定短肽的氨基酸序列，是多肽氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀的原理現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五氨肽酶（aminopeptidase）法氨肽酶是專(zhuān)門(mén)水解肽鏈N-末端氨基酸的一類(lèi)外切酶（exopeptidase）,它們能從多肽鏈的N-末端逐個(gè)地向里切。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基酸種類(lèi)和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)，就能知道該多肽鏈的N-末端氨基酸是什么。此法測(cè)定有很多困難，因酶對(duì)肽鍵的敏感性不同，常很難判斷哪個(gè)殘基在前，哪個(gè)在后。亮氨酸氨肽酶(leucineaminopeptidase,LAP)是最常用的氨肽酶，其作用位點(diǎn)是：(N-端)Leu(或非極性aa)－CO↓NH－aa(除Pro,Hyp外)現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五①肼解法是測(cè)定C-末端最重要的化學(xué)方法，多肽同肼（聯(lián)氨）在無(wú)水條件下加熱，C-末端aa被切割下來(lái)以游離形式存在，而其他的aa轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的氨基酸酰肼化合物;氨基酸酰肼可與苯甲醛作用變?yōu)榉撬苄曰衔?，從而與水溶性的C-末端氨基酸分開(kāi)，C-末端氨基酸可用FDNB法或DNS法以及層析技術(shù)進(jìn)行鑒定。注意，在肼解中，Gln,Asn,Cys,等被破壞，不易測(cè)出，Arg轉(zhuǎn)變?yōu)镺rn現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五肼解反應(yīng)現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五②還原法肽鏈C-末端氨基酸能被硼氫化鋰還原為α-氨基醇，肽鏈完全水解后，代表原來(lái)C-末端氨基酸的α-氨基醇，可用層析法鑒定。Sanger早期就是采用此法鑒定胰島素A，B鏈的C-末端氨基酸的?，F(xiàn)在是24頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五③羧肽酶（carboxypeptidase）法羧肽酶法是最為有效、最常用的方法；羧肽酶是一類(lèi)肽鏈外切酶，它專(zhuān)一地從肽鏈C-末端開(kāi)始逐個(gè)降解，釋放出游離氨基酸。羧肽酶A：···－CH（R）－CO↓NH－aa(除Pro,Arg,Lys外)羧肽酶B：···－CH（R）－CO↓NH－aa(Arg,Lys)羧肽酶C：···－CH（R）－CO↓NH－aa(除Hyp,二肽外)羧肽酶Y：···－CH（R）－CO↓NH－aa(任何氨基酸)現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五羧肽酶（carboxypeptidase）法圖示現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.2肽鏈的拆開(kāi)和分離(-S-S-的斷裂)

二硫鍵的斷裂有過(guò)甲酸氧化法和巰基化合物還原法。用過(guò)量的巰基已醇處理，同時(shí)加變性劑如8M尿素或6M鹽酸胍，然后用烷基化試劑如碘已酸保護(hù)-SH，以防止重新被氧化?，F(xiàn)在是27頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五還原法打開(kāi)二硫鍵現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.3氨基酸組成的分析測(cè)定肽鏈的水解用酸水解，同時(shí)輔以堿水解；6M鹽酸于110℃在真空或充氮的條件下水解10～24h,水解后去除鹽酸，但Trp破壞；也可用甲基磺酸代替鹽酸。堿水解用5M氫氧化鈉于110℃在真空或充氮的條件下水解20h左右，測(cè)出Trp。蛋白質(zhì)的氨基酸組成一般用每mol蛋白質(zhì)中含氨基酸殘基的mol數(shù)表示，或用每100g蛋白質(zhì)中含有的氨基酸克數(shù)表示?，F(xiàn)在是30頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.4肽鏈的部分裂解1）化學(xué)裂解法溴化氰（CNBr）：···－Met－CO↓NH－CH（R）－···羥胺（NH2OH）：Asn↓Gly;Asn↓Leu;Asn↓Ala2)酶裂解法胰蛋白酶（trypsin）糜蛋白酶(chymotrypsin)嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)胃蛋白酶(pepsin)現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五肽鏈的部分裂解－酶法現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.5肽段氨基酸序列的測(cè)定1)Edman降解法2）酶解解法3）質(zhì)譜法4）根據(jù)核苷酸序列的推定法現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.6肽段在多肽鏈中次序的確定－重疊肽法現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五例如：10個(gè)氨基酸殘基的肽鏈用A/B兩種方法的到兩套肽段方法A方法BN-末端殘基A，C-末端殘基S1、AFAFGR2、GRLYLYKW3、KWWHS4、HS10肽的順序：AFGRLYKWHS現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.2.7二硫鍵位置的確定－對(duì)角線(xiàn)電泳①用胃蛋白酶水解多肽鏈，把水解后的混合肽段點(diǎn)到濾紙的中央，在pH6.5的條件下，進(jìn)行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開(kāi)來(lái)。②把濾低暴露在過(guò)甲酸蒸氣中，使-S-S斷裂，含二硫鍵的肽被氧化成一對(duì)含磺基丙氨酸的肽?，F(xiàn)在是36頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五③濾紙旋轉(zhuǎn)900解在與第一向完全相同的條件下進(jìn)行第二向電泳。肽斑用茚三酮顯色確定，大多數(shù)肽段遷移率不變，并位于濾紙的一條對(duì)角線(xiàn)上，只有磺基丙氨酸的肽段偏離了對(duì)解線(xiàn)。④將每對(duì)含磺基丙氨酸的肽段取下，進(jìn)行氨基酸序列分析，然后與多肽鏈的氨基酸序列比較，即可確定二硫鍵的位置?，F(xiàn)在是37頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五對(duì)角線(xiàn)電泳圖示現(xiàn)在是38頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3.3蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)

（databaseordatabank）著名的數(shù)據(jù)庫(kù)：美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)主持的PIR（ProteinInformationResource,蛋白質(zhì)信息庫(kù)；或ProteinIdentificationResource,蛋白質(zhì)鑒定庫(kù)）現(xiàn)在是39頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五美國(guó)政府支持的GenBank(GeneSequenceDataBank,基因序列數(shù)據(jù)庫(kù))歐洲的EMBL（EuropeanMolecularBiologyLaboratoryDataBank,歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)庫(kù)）現(xiàn)在是40頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五4蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系4.1同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化4.2蛋白質(zhì)的激活4.3分子病現(xiàn)在是41頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五一級(jí)結(jié)構(gòu)似，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和功能也相似，例如：不同哺乳類(lèi)動(dòng)物的胰島素分子。一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，蛋白質(zhì)功能不同?，F(xiàn)在是42頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五4.1同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化1）同源蛋白質(zhì)2）細(xì)胞色素C3）系統(tǒng)樹(shù)（進(jìn)化樹(shù)）：物種之間進(jìn)化關(guān)系的圖解現(xiàn)在是43頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五幾個(gè)名詞同源蛋白質(zhì)：在不同生物中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì),同源蛋白質(zhì)一般具有幾乎相同長(zhǎng)度的多肽鏈。同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性，這種相似性稱(chēng)為序列同源（sequencehomology）。現(xiàn)在是44頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中有許多位置的氨基酸殘基對(duì)所有已研究過(guò)的物種來(lái)說(shuō)都是相同的，這樣的aa殘基稱(chēng)為不變殘基（invariantresidue），對(duì)生物功能起決定作用；但其他位置的氨基酸殘基對(duì)不同物種有相當(dāng)大的變化，這樣的殘基稱(chēng)為可變殘基（variableresdue），殘基的變化不影響蛋白質(zhì)的功能，并且能提供物種之間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的信息。現(xiàn)在是45頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五2）細(xì)胞色素C細(xì)胞色素c是廣泛存在于生物體的一類(lèi)同源蛋白，一條肽鏈含有血紅素輔基。物種間親緣關(guān)系越近，細(xì)胞色素c的一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，其空間結(jié)構(gòu)和功能也相似。細(xì)胞色素c的作用是在生物體內(nèi)傳遞電子。細(xì)胞色素c的氨基酸殘基有一部分在不同的生物屬間有差異。現(xiàn)在是46頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五不同物種間細(xì)胞色素C序列間

氨基酸差異數(shù)目的比較現(xiàn)在是47頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五3）系統(tǒng)樹(shù)現(xiàn)在是48頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五系統(tǒng)樹(shù)現(xiàn)在是49頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五現(xiàn)在是50頁(yè)\一共有59頁(yè)\編輯于星期五4.2蛋白質(zhì)的激活1）血液的凝固2）胰島素的形成現(xiàn)在是51頁(yè)\一共有