同工酶實驗2011課件

垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳分離乳酸脫氫酶同工酶

（活性染色鑒定法）

實驗?zāi)康模豪斫馔っ傅母拍罴斑z傳學(xué)意義學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠電泳原理掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳操作技術(shù)掌握乳酸脫氫酶同工酶及酶活性染色同工酶

是指能夠催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶分子結(jié)構(gòu)、理化特性乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。它們是由遺傳體系決定的在不同組織中表達的蛋白質(zhì)作用相同,但分子結(jié)構(gòu)、理化特性等不同。

本實驗做的是乳酸脫氫酶（LDH）的分離鑒定。

夾在兩塊玻璃板之間的凝膠電泳緩沖液電泳緩沖液加在槽中的樣品分子量小分子量大電源電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。混合樣品帶孔膠按分子大小分離電泳方向電泳小分子大分子聚丙烯酰胺凝膠電泳的類型相同孔徑的凝膠、緩沖系統(tǒng)，是利用蛋白質(zhì)分子的主要靠電荷和分子篩效應(yīng)進行分離。不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系的電泳方式，在電泳分離過程中，由于濃縮膠的堆積作用，可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶，對樣品進行濃縮，濃縮效應(yīng)，然后在一定濃度或濃度梯度的凝膠上進行分離，既存在電荷效應(yīng)，也有分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)連續(xù)系統(tǒng)1.凝膠儲備液：A儲備液：pH8.9Tris~HCl緩沖液：1MHCl48ml，36.6gTris，加雙蒸水到80ml，調(diào)節(jié)pH到8.9定容到100ml。B儲備液：pH6.7Tris~HCl緩沖液：1MHCl48ml，5.98gTris，加雙蒸水到80ml，調(diào)節(jié)pH到6.7定容到100ml。C儲備液：分離膠儲備液（30%Acr/Bis）：30gAcr，0.8gBis，用雙蒸水定容到100ml，備用，4℃存放可以保存1個月。D儲備液：濃縮膠儲備液：16gAcr，4gBis，用雙蒸水定容到100ml，備用，4℃可以保存1個月。E儲備液：10%Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。F儲備液：40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml雙蒸水中。TEMED一、試劑：2.電泳緩沖液：Tris6.0g，28.8gGly加雙蒸水到900ml調(diào)節(jié)pH到8.3，定容到1000ml，使用時稀釋10倍。3.乳酸脫氫酶染色劑的配制1M－乳酸鈉0.5mlNAD25mgPMS2mgNBT15mg0.2MTris－Hcl溶液（PH8.0）2ml去離子水定容至50ml器材：

夾心式垂直板電泳槽，梳子，直流穩(wěn)壓電源（電壓300-600V，電流50-100mA），移液槍（各種量程），燒杯（100mL），培養(yǎng)皿取材：鯽魚若干條，解剖取眼、鰓、肺、肝、腸、肉、卵、心臟，放入冰箱保存。提取酶：取不同組織塊，加入提取緩沖液Tris-Hcl(pH=7.0)此溶液需4℃預(yù)冷，組織重量（g）與緩沖液體積（mL）之比為１：5。用研缽研磨充分。漿液4℃離心約30分鐘，15000轉(zhuǎn)／分鐘。取上清液至新管，吸取其中150ul樣品，加100ul甘油和10ul溴酚藍，混勻之后即可點樣。二、樣品的制備三、分離膠的制備儲備液A儲備液C儲備液雙蒸水E儲備液TEMED總體積用量（ml）2.55.012.5100ul10ul20配方表TEMED最后一個加入，輕輕混勻，操作迅速。膠高度距樣品凹玻璃板下緣約1cm，用移液槍在凝膠表面沿短玻板邊緣輕輕加一層水以隔絕空氣，并使膠面平整。水與凝固的膠面有折射率不同的界限，用濾紙吸去多余的水。四、濃縮膠的制備TEMED最后一個加入，輕輕混勻，操作迅速。濃縮膠液高度到凹玻璃板下緣0.5cm左右，然后插入樣品梳，注意不要產(chǎn)生氣泡。約30分鐘后，凝膠完全。小心拔出樣品梳（兩端同時向外拔）。儲備液B儲備液D儲備液雙蒸水F儲備液E儲備液TEMED總體積用量（ml）1.252.51.2560ul16ul10配方表五、電泳

電壓和電流：電壓180V，電流流18－30mA；溴酚藍跑至分離膠末端，電泳結(jié)束。六、染色與觀察揭去上面長型玻璃板，凝膠從短型玻璃板上剝離，慢慢地把膠板沖入白瓷盤或大培養(yǎng)皿內(nèi)，避光于37度搖床中染30min。觀察拍照m：肌肉（muscle）；l：肝臟（liver）；k：腎臟（kidney）；s：脾臟（spleen）；h：心（heart）；e：眼睛（eye）；f：鰭（fin）；g：鰓（gill）；b：腦（brain）謝謝附：分離膠、濃縮膠配方儲備液A儲備液C儲備液雙蒸水E儲備液(APS)TEMED總體積用