花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)演示文稿

花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有51頁\編輯于星期五（優(yōu)選）花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)現(xiàn)在是2頁\一共有51頁\編輯于星期五花的結(jié)構(gòu)現(xiàn)在是3頁\一共有51頁\編輯于星期五現(xiàn)在是4頁\一共有51頁\編輯于星期五四分體:醋酸洋紅染色四分體:Alexander’s染色單核期雙核期成熟花粉粒處于不同發(fā)育時期的煙草小孢子現(xiàn)在是5頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥是花的雄性器官，花藥培養(yǎng)屬器官培養(yǎng)；花粉是單倍體細(xì)胞，花粉培養(yǎng)與單細(xì)胞培養(yǎng)相似花藥和花粉都可以在培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)單倍體細(xì)胞系和單倍體植株。單倍體植株經(jīng)過染色體加倍就成為純合二倍體植株，這樣可縮短育種周期，獲得純系?；ㄅ嘁殉蔀橹参镉N的一種重要手段。

一、概述現(xiàn)在是6頁\一共有51頁\編輯于星期五植物的花粉是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的，其染色體數(shù)目只有體細(xì)胞的一半，叫做單倍體細(xì)胞(haploidcell)?；ǚ酆突ㄋ幍呐囵B(yǎng)(pollenandantherculture)是指花粉在培養(yǎng)基上改變其正常發(fā)育和機能，不經(jīng)受精而發(fā)生細(xì)胞分裂，由單個花粉粒發(fā)育成完整植株的技術(shù)。用離體培養(yǎng)花藥的方法使花粉發(fā)育成一個完整的植株，叫做單倍體植物(haplobiont)。一、概述現(xiàn)在是7頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥培養(yǎng)是將花粉發(fā)育至一定階段的花藥接種到人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，以形成花粉胚或愈傷組織進而分化成植株的技術(shù)。兩者的異同點培養(yǎng)目的相同，均獲得小孢子植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)屬于器官培養(yǎng)；而花粉培養(yǎng)屬于細(xì)胞培養(yǎng)?；ǚ叟囵B(yǎng)沒有藥壁組織干擾；可計數(shù)小孢子產(chǎn)胚率；可觀察雄核發(fā)育的全過程；單倍體產(chǎn)量高。但技術(shù)更復(fù)雜?，F(xiàn)在是8頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥或花粉培養(yǎng)的作用：供體植株小孢子（n）花培花粉植株（n）雄核發(fā)育自然加倍人工加倍純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系1、作物育種（1）縮短育種周期：常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小

孢子培養(yǎng)僅需一年?，F(xiàn)在是9頁\一共有51頁\編輯于星期五大大縮短育種周期通過多次自交或近交獲得的幾乎是同質(zhì)結(jié)合的品系單倍體植株再通過某種手段使染色體組加倍（如秋水仙素處理）從而使植物恢復(fù)正常染色體數(shù)現(xiàn)在是10頁\一共有51頁\編輯于星期五例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株常規(guī)方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/16，并且不能將AAbb與Aabb、aAbb區(qū)分開。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

AB

aB

Ab

abAB AABB AaBB AABb AaBbaB aABB aaBB aABb aaBbAb AabB AabB AAbb

Aabbab aAbB aabB aAbb aabb現(xiàn)在是11頁\一共有51頁\編輯于星期五例子：二倍體供體植株基因型為AaBb，若要從后代中選擇基因為AAbb的純合單株單倍體方法：AAbb出現(xiàn)的概率為1/4。

（2）提高了目標(biāo)基因型的選擇效率

單倍體

二倍體

AB-------------------------->AABB

aB---------------------------->aaBB

Ab---------------------------->AAbb ab---------------------------->

aabb供體親本AaBb花培現(xiàn)在是12頁\一共有51頁\編輯于星期五

植株不受顯隱性的影響，在誘變育種中能在當(dāng)代及時獲得突變個體，加倍后成為穩(wěn)定的純系。

（3）誘變育種中的作用

現(xiàn)在是13頁\一共有51頁\編輯于星期五2、物種進化研究可探索親本染色體組的構(gòu)成。分析單倍體植物減數(shù)分裂時，形成二價體的數(shù)目和形狀，能確定染色體組內(nèi)是否存在同源染色體。

3、遺傳分析單倍體植株中基因不受顯隱性的影響，每一個基因的作用均能表現(xiàn)出來。能用來研究基因的性質(zhì)及其作用。還可用于基因的劑量效應(yīng)分析。4、構(gòu)建連鎖圖譜雙單倍體（DH）群體是永久性群體，能有效地用于遺傳圖譜的構(gòu)建5、用于遺傳轉(zhuǎn)化能直接表達外源基因，不受顯隱性影響現(xiàn)在是14頁\一共有51頁\編輯于星期五

花藥培養(yǎng)簡史1964年：印度學(xué)者古哈(Guha)和馬斯瓦瑞（Maheswari）將南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚1967年：包金(Bourgin)和尼奇(Nitsch)花藥培養(yǎng)獲得煙草植株1973年：我國首次報道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟植物通過花粉培養(yǎng)都能誘導(dǎo)成植株現(xiàn)在是15頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥培養(yǎng)的主要目的，是培育花粉粒的單倍體植株，并使單倍體加倍，作為育種材料的來源。利用雜種花藥離體培養(yǎng)獲得的再生植株，由不同基因型的配子發(fā)育而來，具有豐富的變異類型，選擇出有利的變異類型，經(jīng)過經(jīng)濟性狀鑒定后，選出優(yōu)良者直接用于生產(chǎn)或配制雜交組合，獲得優(yōu)良雜交種子。構(gòu)建永久性分離群體－雙單倍體系（Doubledhaploid)，用于基因定位。雙單倍體：是指單倍體細(xì)胞（花粉或卵細(xì)胞）經(jīng)過人工或自發(fā)加倍后得到雙單倍體細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化可發(fā)育為單雙倍體植株。

花藥培養(yǎng)與單倍體育種現(xiàn)在是16頁\一共有51頁\編輯于星期五

1、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個階段，最后子葉展開，形成花粉植株。2、愈傷組織發(fā)育途徑小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜?；ǚ壑仓晷螒B(tài)發(fā)生方式現(xiàn)在是17頁\一共有51頁\編輯于星期五胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過胚狀體途徑形成小植株煙草花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是18頁\一共有51頁\編輯于星期五通過胚狀體途徑再生形成小植株煙草花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是19頁\一共有51頁\編輯于星期五胚狀體發(fā)育途徑a)球形胚d)魚雷形胚蕓苔屬小孢子培養(yǎng)現(xiàn)在是20頁\一共有51頁\編輯于星期五愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是21頁\一共有51頁\編輯于星期五愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株水稻花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是22頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥培養(yǎng)1、取材鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時期，選取大小適宜的花蕾。

2、消毒

70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸鈉溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，無菌水沖洗3-5次。3、培養(yǎng)固體或液體培養(yǎng)基均可。先進行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。現(xiàn)在是23頁\一共有51頁\編輯于星期五花粉培養(yǎng)(一)花粉的分離與純化1、自然散落法(漂浮培養(yǎng)散落小孢子收集法)

將花藥接種在預(yù)處理液或液體培養(yǎng)基上，待花粉自動散落后，收集培養(yǎng)。2、擠壓法在燒杯或研缽中擠壓花藥，將花粉擠出后收集培養(yǎng)。3、機械游離（1）磁攪拌法用磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)液中的花藥，使花粉游離出來；（2）超速旋切法通過攪拌器中的高速旋轉(zhuǎn)刀具破碎花蕾、穗子、花藥，使小孢子游離出來（此法應(yīng)用最廣）。4、小孢子純化對上述方法獲得的小孢子混合物進行分級過篩、梯度離心處理純化小孢子現(xiàn)在是24頁\一共有51頁\編輯于星期五梯度離心前（小孢子形態(tài)、活力不一致）30%蔗糖梯度離心后（獲得均一的小孢子群體）現(xiàn)在是25頁\一共有51頁\編輯于星期五(二)花粉培養(yǎng)方式1、平板培養(yǎng)花粉置瓊脂固化培養(yǎng)基上培養(yǎng)。2、液體培養(yǎng)花粉懸浮在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，需震蕩，以利通氣。3、雙層培養(yǎng)花粉置固體-液體雙層培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)基制作方法：先鋪一層瓊脂固體培養(yǎng)基，凝固后，在表面加入少量液體培養(yǎng)基。

4、看護培養(yǎng)利用花藥或花藥愈傷組織釋放出的活性物質(zhì)促進花粉小孢子發(fā)育。5、微室培養(yǎng)利用小的蓋玻片和凹穴載玻片形成微室進行花粉培養(yǎng)6、條件培養(yǎng)基培養(yǎng)利用培養(yǎng)過花藥的液體培養(yǎng)基或含失活花藥提取物的培養(yǎng)基上培養(yǎng)?；ㄋ帡l件培養(yǎng)基、子房條件培養(yǎng)等?，F(xiàn)在是26頁\一共有51頁\編輯于星期五看護培養(yǎng)圖解現(xiàn)在是27頁\一共有51頁\編輯于星期五確定取材時間選擇大致處于所需要時期的花蕾。由于花粉發(fā)育時期和植株的某些外部形態(tài)特征之間的大致相關(guān)性，因此利用這些外部標(biāo)志，選擇符合條件的花蕾，經(jīng)鏡檢確定花粉發(fā)育的準(zhǔn)確時期。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5～15cm，穎片（禾本科植物小穗基部，由苞片轉(zhuǎn)變而成）淡黃綠色、雄蕊長度接近穎片長度的1/2這些條件來判斷?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)現(xiàn)在是28頁\一共有51頁\編輯于星期五在培養(yǎng)基中加入活性炭能促進花藥培養(yǎng)水稻的柱頭-花藥現(xiàn)在是29頁\一共有51頁\編輯于星期五選取主穗（一級側(cè)枝）的花蕾，因為一級側(cè)枝的花蕾發(fā)育良好，數(shù)量大，發(fā)育同步。操作過程中不應(yīng)使花藥受到損傷，若受損傷，則應(yīng)淘汰，因為損傷常常會刺激花粉壁形成二倍體的愈傷組織。注意事項水稻花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是30頁\一共有51頁\編輯于星期五水稻花藥培養(yǎng)旗葉鞘用70％酒精擦洗一遍剝?nèi)テ烊~鞘，取出稻穗左手持穗，右手用鑷子取出花藥，無菌培養(yǎng)皿中70％酒精，洗2遍用接種環(huán)接種到培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天后，花藥變黑褐色，20天花藥裂開，長出淡黃色的花粉愈傷組織，先形成芽，后長出根，形成幼苗?，F(xiàn)在是31頁\一共有51頁\編輯于星期五光照(12~18h，5,000~10,000lx，28℃)黑暗(12-16h，22℃)周期交替進行?；ㄋ幣囵B(yǎng)的條件現(xiàn)在是32頁\一共有51頁\編輯于星期五①花粉發(fā)育時期是影響培養(yǎng)效果的重要因素在誘導(dǎo)花粉進行雄性發(fā)育(指小孢子沿孢子體途徑發(fā)育成花粉植株)過程中，不同物種花粉最適的發(fā)育時期不同，對多數(shù)植物來說，單核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。如南洋金花、煙草和芍藥中的最適時期是第一次有絲分裂時期或稍前后，禾本科植物在單核早期(大麥)或單核中期(玉米、小麥)反應(yīng)最好，番茄在減數(shù)分裂中期時更適宜。1、影響花藥誘導(dǎo)頻率的因素現(xiàn)在是33頁\一共有51頁\編輯于星期五②花藥供體植株的生長條件對花藥培養(yǎng)反應(yīng)的影響很大例如：水稻、小麥、大麥等禾本科植物，主莖穗比分蘗穗花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯地提高，同步化程度高。現(xiàn)在是34頁\一共有51頁\編輯于星期五③培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動和再分化的重要條件我國科學(xué)工作者對水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培養(yǎng)基的特點是銨離子濃度較低。隨后，進一步降低銨鹽和硝酸鹽濃度，同時附加生物素，研制出C17和W14培養(yǎng)基，它們可以大幅度提高小麥的花藥出愈率。以馬鈴薯提取液為基本成分的馬鈴薯培養(yǎng)液，現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于小麥花藥培養(yǎng)，效果良好。

現(xiàn)在是35頁\一共有51頁\編輯于星期五培養(yǎng)基中的植物生長物質(zhì)的種類會影響花粉發(fā)育的途徑一般在禾本科植物中，常用1～5mg/L2,4-D或NAA誘導(dǎo)花粉愈傷組織形成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長素或補加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植株形成?，F(xiàn)在是36頁\一共有51頁\編輯于星期五培養(yǎng)基中糖的種類對花粉胚的誘導(dǎo)和分化有顯著影響朱至清等(1990)報道在過濾滅菌的條件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液體培養(yǎng)基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可增加2～10倍。一般說來，高蔗糖濃度可以抑制體細(xì)胞的生長而對花粉的生長無妨礙。最適蔗糖濃度：煙草的為3％水稻為3％～6％玉米則為12％～15％現(xiàn)在是37頁\一共有51頁\編輯于星期五以1～5℃預(yù)低溫處理小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。例如，在4℃下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)處理4天、8天和12天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫對照分別提高2.4倍、1.9和1.5倍。各種植物要求預(yù)處理的溫度和時間不同。2、低溫預(yù)處理可以提高花粉胚的誘導(dǎo)頻率現(xiàn)在是38頁\一共有51頁\編輯于星期五小麥要求先高溫培養(yǎng)64天之后，再轉(zhuǎn)入28～30℃下培養(yǎng)。一直高溫培養(yǎng)效果并不好。較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆囵B(yǎng)溫度仍是減少白化苗的一個有效措施。培養(yǎng)溫度是影響花藥反應(yīng)的一個重要因素現(xiàn)在是39頁\一共有51頁\編輯于星期五3、花藥培養(yǎng)過程花藥材料的選取關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花藥，離體培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花藥，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花藥培養(yǎng)，成功率最高的時期為單核期，或單核中晚期?，F(xiàn)在是40頁\一共有51頁\編輯于星期五黃心烏花藥培養(yǎng)甜椒花藥培養(yǎng)現(xiàn)在是41頁\一共有51頁\編輯于星期五草莓花藥愈傷組織再生植株花藥植株現(xiàn)在是42頁\一共有51頁\編輯于星期五杜蘭小麥的花藥培養(yǎng)A花藥在BAD-3誘導(dǎo)下，3周后形成胚狀體和愈傷組織B另一個花藥在BAC-1培養(yǎng)基中已愈傷組織中長出葉片C

更多的花藥在BAD-3培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織與子葉D

從BAC-1轉(zhuǎn)移到BAD-1分化培養(yǎng)基中形成的愈傷組織E

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-6周，愈傷組織開始分化根和綠色的新芽F

在MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-8周，可形成大量的根和幼莖G在MS再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)8周后，可由最初的花藥形成小植株H由花藥形成的健壯小植株I

花藥形成的植株在同樣的MS再生培養(yǎng)基中生長，可因培養(yǎng)條件改變而形成不正常的植株現(xiàn)在是43頁\一共有51頁\編輯于星期五花粉植株染色體可自發(fā)加倍人工措施染色體加倍傳統(tǒng)方法是用秋水仙素處理。較大濃度的秋水仙素溶液處理單倍體植株，時間為24～96h。浸泡試管苗方法處理芽方法浸根方法單倍體植株的二倍化現(xiàn)在是44頁\一共有51頁\編輯于星期五花藥培養(yǎng)脫毒1974年日本：花藥培養(yǎng)可以脫除草莓病毒；花藥采取時期單核期：花蕾4-6mm，花藥1mm花藥誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基MS