生物分離工程第八章電泳技術(shù)課件

電泳技術(shù)

Electrophoresis本章主要知識點電泳的概念電泳的基本原理電泳技術(shù)的分類常用的凝膠電泳技術(shù)有哪些？電泳裝置的基本組成聚丙稀酰胺凝膠電泳的一般過程SDS電泳的基本原理及過程瓊脂糖電泳的特點及其應(yīng)用等電聚焦電泳的基本原理雙相電泳的概念及其特點電泳概念A(yù)rneTiselius——物理化學(xué)家、諾貝爾獎金獲得者定義——荷電的膠體粒子在電場中的移動；電泳決定于環(huán)繞每個離子的離子霧中的擴散雙電層，離子尺寸越大、溶液中的離子強度越高時，電泳現(xiàn)象變得越明顯。因此，電泳現(xiàn)象中的表面電勢和雙電層的因素起著決定性的作用。電泳的簡單原理蛋白質(zhì)、核酸、多糖等常以顆粒分散在溶液中，它們的凈電荷取決于介質(zhì)的H+濃度或與其它大分子的相互作用。帶電粒子在電場中的遷移方式主要依據(jù)分子尺寸大小和形狀、分子所帶電荷或分子的生物學(xué)與化學(xué)特性。電泳遷移率電泳遷移率（mobility）:在電位梯度E的影響下，帶電顆粒在時間t中的遷移距離d。其單位是cm2·sec-1·V-1電泳遷移率的不同提供了從混合物中分離不同物質(zhì)的基礎(chǔ)電泳的大致分類依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng)移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis）區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系統(tǒng)。區(qū)帶電泳的主要技術(shù)區(qū)帶電泳中的常用技術(shù)載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳無載體電泳：自由電泳、毛細管電泳丙烯酰胺的聚合丙烯酰胺的聚合通常是由化學(xué)或光化學(xué)過程完成的，通常采用過硫酸銨、過硫酸鉀或核黃素（引發(fā)劑）來引發(fā)該過程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）為增速劑。該引發(fā)-增速的催化系統(tǒng)實質(zhì)是自由基催化的氧化-還原過程。丙烯酰胺的化學(xué)聚合是由過硫酸銨在堿性條件下，產(chǎn)生游離氧自由基引發(fā)單體丙烯酰胺成為自由基狀態(tài)，經(jīng)過一系列的自由基反應(yīng)得到的聚合物；影響聚合的主要因素引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過大則易導(dǎo)致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在40~60分鐘內(nèi)完成。系統(tǒng)pH值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值，以獲得最佳的聚合結(jié)果；溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；聚丙烯酰胺凝膠電泳中的分子篩效應(yīng)在使用凝膠介質(zhì)的電泳中，由于電泳介質(zhì)具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不僅可以防止對流，而且可以把擴散減到最小。凝膠中的大分子分離取決于它的電荷、尺寸和形狀凝膠的這種用于分離不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸篩分能力（Sizesievingcapacity），這種現(xiàn)象被稱為分子篩效應(yīng)（molecularsievingeffect）瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點其優(yōu)點如下：瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm，可以分析百萬道爾頓分子量的大分子，但分辨率較凝膠電泳低。機械強度高：可以在濃度1%以下使用；無毒；染色、脫色程序簡單，背景色較低；熱可逆性；生物中性：一般不與生物材料結(jié)合；電內(nèi)滲（EEO）大：對于對流電泳有益電泳新介質(zhì)N-取代聚丙烯酰胺介質(zhì)：Poly-N-acryl-tris(NAT)gelN-AcryloylsugarsAcryloylmorpholineHydrolinkgelsN-acryloylaminoethoxyethanol(AAEE)特點：具有極強的水解穩(wěn)定性具有高度親水性孔徑大電泳系統(tǒng)的基本組成電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳槽、水平板電泳槽電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200~600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦電泳1000~2000V，固相梯度等電聚焦3000~8000V外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻；凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥；灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子；電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大電流的直流電場，使凝膠電泳的分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜垂直電泳槽及灌膠模具電泳的一般過程電泳前的準(zhǔn)備工作緩沖系統(tǒng)的選擇：保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的保持；電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任何pH進行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生某種水解（脫酰胺）。因此，pH應(yīng)限制在3~10之間。緩沖系統(tǒng)的選擇原則是兩種標(biāo)準(zhǔn)的對立權(quán)衡如果緩沖液的pH選擇在遠離樣品中各種蛋白的等電點，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時間短，區(qū)帶細而窄；如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別大，分辨率就高；

因此，常常選擇pH8.0~9.5的緩沖，常用的緩沖液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）凝膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；凝膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質(zhì)分子均隨緩沖液推進，不能得到很好的分離；凝膠濃度(C=2.6%)分子量范圍(kDa)凝膠濃度(C=5%)分子量范圍(kDa)530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系PAGE的具體操作過程制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖液），使用灌膠模具灌膠；樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度（1~2mg/L，考染），加樣（溴酚藍）；電泳：4~6小時，待溴酚藍前沿到達陽極底部；檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍R-250、銀染色—靈敏度比考染高100倍、熒光探針）；照相、凝膠干燥：定量測定：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的測定；特點：設(shè)備簡單、操作簡便、測定快速、重復(fù)性高、樣品無需純化。SDS的原理蛋白質(zhì)分子的解聚SDS是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的二級、三級結(jié)構(gòu)；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、β-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。因此，在樣品和凝膠中加入SDS和還原劑后，蛋白質(zhì)分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側(cè)鏈與SDS結(jié)合后，形成帶負電的蛋白質(zhì)-SDS膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質(zhì)-SDS聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變未知蛋白質(zhì)分子量的測定基于上述SDS的原理介紹，我們可以利用SDS電泳進行未知蛋白質(zhì)的分子量測定；以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進行SDS電泳得到不同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行SDS電泳，測定遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量；載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦等電聚焦（isoelectrofocusing）,IEF 利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進行蛋白質(zhì)的分離和分析。利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白質(zhì)和兩性分子。根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩性電解質(zhì)梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。工作原理蛋白質(zhì)的等電點 蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負電，只是在某一pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋白的等電點（isoelectricpointpI）。蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象，是一個物理化學(xué)常數(shù)。可以利用等電點差異來進行蛋白質(zhì)的分離、分析

載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦原理載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦是在支持介質(zhì)中加入載體兩性電解質(zhì)，通以直流電后在兩極之間形成穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度，當(dāng)帶電的蛋白質(zhì)分子進入該體系時，便會產(chǎn)生移動，并聚集于相當(dāng)于其等電點的位置。等電聚焦分離示意圖常規(guī)PAGE和等電聚焦電泳的區(qū)別載體兩性電解質(zhì)和pH梯度的形成等電聚焦技術(shù)的關(guān)鍵在于pH梯度的建立載體兩性電解質(zhì)的概念：

作為載體兩性電解質(zhì)應(yīng)該具有以下特點：應(yīng)該是兩性的，使它們在分離柱中也能達到一個平衡位置；應(yīng)該可以作為“載體”，兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦，只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的導(dǎo)電性和好的緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。用于等電聚焦的主要載體兩性電解質(zhì)Ampholine(瑞典LKB公司)由許多脂肪族的多氨基多羧基的異構(gòu)體和同系物組成，它們具有連續(xù)改變的氨基與羧基比Servalyte(德國Serva公司)產(chǎn)品BiolytePharmalyte(瑞典Pharmacia公司)產(chǎn)品分為九種pH范圍pH梯度的形成在沒有電場時，載體兩性電解質(zhì)的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電。當(dāng)引入電場時，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點的分子（荷最多負電）將最快地向陽極移動；當(dāng)它達到凈電荷為0的位置時才停止，這個位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。其次，一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷其次多的負電）也向陽極移動，直到它的凈電荷減少到0才停止。同樣的，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級數(shù)的方法將分別在陽極、陰極之間到達它們自己的位置，從而給出一個pH梯度。載體兩性電解質(zhì)在電場中

形成pH梯度的模式圖水平等電聚焦電泳制膠：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉雙丙烯酰胺、載體兩性電解質(zhì)等），灌膠；電泳：加樣可在凝膠上的任何位置，濃度一般為0.5~2mg/ml；固定：染色：脫色：等電聚