《醫(yī)學免疫學》補體結合實驗

50%溶血試驗（50%complementhemolysis,CH50）測定血清總補體活性精選課件

一、實驗原理補體最重要的活性是溶細胞作用。特異性抗體與紅細胞結合可激活補體引起溶血，溶血程度與補體的活性相關。溶血反應對補體的劑量依賴呈一特殊的S形曲線，該曲線在30%~70%之間最陡，幾乎呈直線，即此階段對補體量的變化非常敏感，因此實驗常以50%溶血作為判斷終點來測定血清總補體活性，這一方法稱為補體50%溶血實驗（CH50）。精選課件精選課件二、試劑1、綿羊紅細胞（SRBC）：無菌采靜脈血，除去纖維蛋白后，洗滌配成2%濃度應用。2、溶血素：抗綿羊紅細胞抗體，需提純后滅活補體。用稀釋緩沖液稀釋至2單位。3、稀釋緩沖液：PH7.4巴比妥緩沖液精選課件三、方法1、待檢標本的處理：取試管一支加待測血清0.20ml，加入3.80mlpH7.4巴比妥緩沖液，使血清為1：20稀釋。2、取1列10支試管，從1~10編號，第1~9為測定管，第10管為對照管。按表進行加樣。3、50%溶血標準管全溶管：2%SRBC1ml+4ml蒸餾水混勻靜置10min50%溶血管：2ml全溶管液體+2mlpH7.4巴比妥緩沖液。4、上述所有試管經(jīng)2500rpm，離心5min后，與50%溶血管肉眼初步比較，取較接近的2管進行比色，確定最接近50%溶血管的管號。精選課件四、結果判斷：根據(jù)最接近50%溶血管的管號，查出該管所加待檢血清標本量，按下列公式計算：CH50（U/ml）=1/50%溶血管的血清用量（ml）×稀釋倍數(shù)正常范圍：50~100U/ml精選課件

補體結合試驗

（complementfixationtest，CFT）精選課件一、原理

Ag和相應Ab反應所形成的免疫復合物（IC）能吸附（固定）并激活補體。5種成份分屬于：⑴反應系統(tǒng)；⑵補體系統(tǒng)；⑶指示系統(tǒng)。反應、指示系統(tǒng)競爭結合補體系統(tǒng)。先加入反應系統(tǒng)，優(yōu)先結合補體。若反應系統(tǒng)中待測的Ab（或Ag）與已知Ag（或Ab）相對應，則Ag與Ab形成IC后可結合補體；再加入指示系統(tǒng)時，因已沒有游離的補體而不出現(xiàn)溶血，為補體結合試驗陽性。若不相對應，將會有游離的補體參與指示系統(tǒng)的反應，最終會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，為陰性。精選課件補體結合試驗圖示受檢系統(tǒng)指示系統(tǒng)溶血反應補體結合試驗1、僅有抗原或抗體補體紅細胞溶血素陽性陰性2、抗原抗體反應紅細胞溶血素陰性陽性抗原抗體補體抗原/抗體精選課件二、試劑1、受檢抗原、抗血清（56℃30min滅活，1:50稀釋）。2、補體（豚鼠新鮮血清，2u）、1%綿羊紅細胞（SRBC）、溶血素（2u）。3、生理鹽水、試管、吸管、水浴箱等。精選課件

三、方法1、溶血素效價的滴定按照下表操作以顯示全溶的溶血素最高稀釋度作為溶血素的效價。在補體結合試驗時，溶血素的效價也稱之為1個溶血素單位，在正式試驗時一般采用2個溶血素單位。精選課件管溶血素││2單位│pH7.4巴│2％羊│號稀釋度│溶血素│補體│比妥緩沖│紅細胞│假定結果────┼───┼───┼────┼───┼────11:300│0.25│0.15│0.85│0.25│放│全溶21:400│0.25│0.15│0.85│0.25│置│全溶31:500│0.25│0.15│0.85│0.25│37│全溶41:600│0.25│0.15│0.85│0.25│℃│全溶51:800│0.25│0.15│0.85│0.25│水│全溶61:1000│0.25│0.15│0.85│0.25│浴│全溶71:1200│0.25│0.15│0.85│0.25│30│全溶81:1600│0.25│0.15│0.85│0.25│分│微溶91:2000│0.25│0.15│0.85│0.25│鐘│微溶101:2400│0.25│0.15│0.85│0.25││不溶111:3200│0.25│0.15│0.85│0.25││不溶121:4000│0.25│0.15│0.85│0.25││不溶131:4800│0.25│0.15│0.85│0.25││不溶141:6400│0.25│0.15│0.85│0.25││不溶精選課件2、補體滴定：一般用豚鼠補體，每次試驗前均應滴定按照下表操作以能產(chǎn)生完全溶血的最少量的補體為1個“恰定單位”，全溶第2管為1個“實用單位”。正式試驗時使用2個實用單位。精選課件補體效價滴定

管號1:60補體(ml)pH7.4巴比妥緩沖液(ml)稀釋抗原(ml)注①1%致敏羊紅細胞(ml)注②假定結果10.010.290.1放置37℃水浴10min0.2放置37℃水浴30min不溶血20.020.280.10.2不溶血30.030.270.10.2不溶血40.040.260.10.2微溶血50.050.250.10.2微溶血60.060.240.10.2全溶（1個恰定單位）70.080.220.10.2全溶（1個實用單位）80.100.200.10.2全溶90.120.180.10.2全溶100.150.150.10.2全溶精選課件注①:為了排除抗原或抗體的抗補體作用，需在補體滴定的同時加入抗原或抗體（如待檢系統(tǒng)中以抗原測定未知抗體，需加入抗原，反之則加抗體）。注②:指稀釋好的每2單位溶血素與等量2％綿羊紅細胞懸液混合，置室溫作用20～30分鐘即可。精選課件效價計算：從上表可以看出：0.06ml1:60稀釋的補體為1個“恰定單位”，0.08ml為1個“實用單位”。補體結合試驗用2個“實用單位”，則0.16ml1:60稀釋補體相當于2個“實用單位”。由于正式試驗時所加入的補體量為0.2ml，因此需按下公式算出所用補體的稀釋倍數(shù)。0.08×2：60＝0.2：X60×0.2X＝─────＝750.08×2即將豚鼠血清用pH7.4巴比妥緩沖液作1:75稀釋后，每0.2ml中含2個實用單位的補體。精選課件3、抗原和抗體的滴定：一般采用方陣滴定法，選擇抗原與抗體均呈強陽性反應的最高稀釋度作為抗原和抗體的效價（或單位）。正式試驗時，抗原一般用2~4個單位，抗體采用4個單位。精選課件4、補體結合正式試驗按照講義的表操作應作抗原或血清對照管，SRBC、溶血素對照管。精選課件四、結果觀察1、管內液體混濁呈淺紅色為不溶血，管內液體透明呈紅色為溶血。2、第2、3、4管為對照管均應溶血，第5管為綿羊紅細胞對照不應溶血。凡第1管紅細胞發(fā)生溶血者為補體結合反應陰性，而不溶血者為陽性。精選課件五、實驗報告掌握實驗原理，記錄并分析實驗結果。精選課件

溶血空斑形成實驗（PlaqueFormingtest，PFT）——小室液相法精選課件一、原理小鼠溶血空斑形成試驗：取用綿羊紅細胞（SRBC）免疫過的小鼠脾細胞懸液，與SRBC和補體混合，灌入用玻片制備的透明小室中，孵育后脾細胞可產(chǎn)生抗SRBC抗體與其周圍的SRBC結合，在補體的作用下，即可溶解SRBC而形成透明溶血區(qū)。

檢測實驗動物抗體生成細胞產(chǎn)生IgM的能力。

精選課件二、器材與試劑1、撥片、雙面膠2、細胞培養(yǎng)板、細胞篩等3、SRBC、豚鼠血清（補體）精選課件

三、方法1、免疫小鼠2、制備脾細胞懸液3、制備10%SRBC4、補體制備5