偽狂犬病毒PCR診斷

偽狂犬病毒PCR診斷實驗目的：1、了解PCR反應的原理、方法及操作步驟；2、掌握偽狂犬病毒PCR檢測的方法；實驗內(nèi)容：1、講述PCR反應的原理、方法及操作步驟，讓同學們觀看PCR反應的動畫；2、偽狂犬病毒PCR檢測。2020/11/42什么是PCR？

聚合酶鏈式反應（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。一、PCR反應的原理、方法及操作步驟2020/11/43PCR及有關技術的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實驗）發(fā)明了PCR。1985關于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)2020/11/44PCR及有關技術的發(fā)展歷史（2）1987當年7月Cetus公司在美國獲得PCR基本技術專利批準。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個PCR試劑產(chǎn)品及第一臺熱循環(huán)儀。1989Science報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。2020/11/45PCR及有關技術的發(fā)展歷史（3）1992年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴增儀等專利；

KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學獎。2020/11/46PCR及有關技術的發(fā)展歷史（4）九十年代中期PCR臨床應用在國內(nèi)全面展開1998年實時熒光PCR技術開始在中國較廣泛的應用于臨床檢測1999年西方發(fā)達國家嘗試將PCR應用于血液篩查2020/11/47PCR原理PCR是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細胞分裂中的DNA半保留復制機理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增。2020/11/48PCR原理PCR技術在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán)（2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增。2020/11/49（1）DNA模板的熱變性

將待擴增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應體系中作為模板。（2）模板與引物的結(jié)合（退火或復性）

將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結(jié)合。2020/11/410（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

以上為1次PCR循環(huán)（變性、復性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）

按照上述（變性、復性和延伸）3個步驟反復循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴增。

模板DNA擴增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。2020/11/411PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension2020/11/412PCRproduct2020/11/413標準的PCR反應體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul2020/11/4142020/11/4152020/11/4162.PCR各要素及其作用（1）模板PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝；RNA作為模板時，需要：RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)是從耐熱細菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。逆轉(zhuǎn)錄2020/11/417酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應約需酶量2.5U（指總反應體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少2020/11/418引物引物是PCR特異性反應的關鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增2020/11/419引物設計的原則（一）①引物長度：15-30bp，常用為20bp左右引物的有效長度不能大于38bpmer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列2020/11/420引物設計的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處2020/11/421引物設計的原則（三）⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好.引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會.2020/11/422引物在線設計網(wǎng)址：primer/primer3_2020/11/4232020/11/4242020/11/425dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關系dNTP呈顆粒狀，保存不當易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低2020/11/426Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應中，各種NTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少2020/11/427PCR反應條件的選擇PCR反應條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)2020/11/428溫度與時間的設置：設置變性-退火-延伸三個溫度點標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸2020/11/429①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導致PCR失敗2020/11/430

②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想2020/11/431引物的復性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。2020/11/432③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至15min延伸進間過長會導致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些2020/11/433循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多2020/11/434（6）參數(shù)

變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃

延伸溫度與時間

一般選擇：70℃

75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次2020/11/435PCR反應特點特異性強靈敏度高簡便、快速對標本的純度要求低2020/11/436PCR產(chǎn)物分析凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。同時應以