植物3羥3甲戊二酰輔酶AHMGCOA還原酶活性直接光度法

植羥-甲戊酰酶A（還酶性接度定檢試盒品明（文）主用植物3-羥-3-戊二酰輔酶AHMG-COA）還原酶活性直光度法定量檢測試劑是一種旨在運(yùn)用羥-3-甲戊二酰輔酶A作為底物，在還原酶的催化下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后吸光峰值的降低，即采用光度法來測定植物裂解樣品中酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制功實(shí)驗(yàn)證明的適用于各種植物組織括種cotyledon上胚軸（epicotyl）等裂解懸液、微粒體，或純化酶樣品3-羥-甲戊二酰輔酶AHMG-COA）還原酶的活性檢測，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。技背甲戊二羥酸通路mevalonatepathway稱為3-羥戊二酰輔酶（HMG-COA）還原酶路或甲戊二羥酸依賴性通路，是所有高等真核生物和許多細(xì)菌具有的重要的細(xì)胞代謝通路，用于體內(nèi)產(chǎn)生二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallylDMAPP）和異戊二烯焦磷酸；IPP）作為生物大分子合成的基礎(chǔ)，包括蛋白質(zhì)異戊二烯化、細(xì)胞膜維護(hù)、激素合成、蛋白固著、蛋白糖化等。羥戊二酰輔酶A原酶（3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreductaseHMGR；）控制甲戊二羥酸通路的關(guān)鍵的酶，調(diào)節(jié)膽固醇和類異戊二烯脂分子的產(chǎn)生還原酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，含有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其中活性結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞漿里。HMG-COA還原酶是許多降脂藥物的靶標(biāo)，包括l（Mevacor）、（Lipitor）、（）和（Zocor）在植物組織中，還原酶位于質(zhì)體、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，組發(fā)育、光照、病原菌感染、創(chuàng)傷等將誘導(dǎo)HMG-COA原酶活性增加。在MG-COA原酶的催化下，將4電子的3羥甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）原為甲戊二羥酸（時(shí)產(chǎn)生還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reducedadeninedinucleotidephosphateNADPH氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷adeninedinucleotidephosphateNADP氧化后的吸光峰值變化波長），來定量分析3-戊二酰輔酶AHMG-COA）還酶的活性。羥-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶反應(yīng)系統(tǒng)為：HMG-COAHMG-CoA++H＋→mevalonateNADP2CoA-SH產(chǎn)內(nèi)清理液（Reagent）裂解液（ReagentB）緩沖液（Reagent）反應(yīng)液（ReagentD底物液（Reagent）陰性液（ReagentF）產(chǎn)品說明書保方

60毫升25毫升3升500升500升500升1

保存裂解液（緩沖液Reagent反應(yīng)液ReagentD和底物液（Reagent）在20℃冰箱里；其余的保存在4冰箱里；反應(yīng)液（ReagentD和底物液（）避免光照；有效保證月用自1.5毫離心管：用于樣品保存的容器15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器DOUNCE勻漿器：用于組勻化（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品制備超速離心機(jī)：用于微粒體制備200升1米光徑比色皿或96孔板：用于光度析的容器分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于光度分析實(shí)步一、品準(zhǔn)備1．準(zhǔn)備好新鮮的植組織（葉片、谷粒、種子等秤重以確定1克組織重量2．（選擇步驟）放預(yù)冷的升錐形離心管3．（選擇步驟）加3升清液（A）清洗次4．即刻用刀片切碎織5．放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管6．加入預(yù)冷的升裂液（B）7．渦旋震蕩5，充分混勻8．即刻放進(jìn)預(yù)冷的勻漿器，在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）9．將所有組織勻漿移入1.5升離心管，放進(jìn)4℃微臺式離心機(jī)離心分鐘，速度為10．小心移出上清（注意：要觸碰沉淀另一個(gè)新的預(yù)冷的升錐形離心管11．（選擇步驟）果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)貜?fù)離心分鐘一次，速度為9000g12．即刻移入到1.5毫升離心管或超速離心管——此為總蛋白樣品13．（選擇步驟）進(jìn)℃超速離心機(jī)離心60分，速度為100000g14．（選擇步驟）心抽去上清液15．（選擇步驟）入微升裂解液（混勻顆粒群—此為微粒體樣品16．移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用

蛋白質(zhì)濃定量試劑盒－17．即刻放進(jìn)70保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作二、定準(zhǔn)備1．開啟并設(shè)定好分光度儀（溫度為25℃長，間隔分鐘，讀數(shù)次（共10分鐘置零2．從－20冰箱里取出試劑，置冰槽里融化；反應(yīng)液（）底物液（ReagentE避免光照3．緩沖液（Reagent）室下均衡溫度

三、景對照測定1．移取140微升緩沖液（Reagent）新的比色皿2．加入微升反應(yīng)液（Reagent）3．加入微升底物液（ReagentE）4．上下傾倒數(shù)次，勻5．在℃溫度下孵育3分6．加入微升陰性液（ReagentF）7．上下傾倒數(shù)次，勻（限定在秒之內(nèi)）8．即刻放進(jìn)分光光儀檢測，此為背景空對照（0分鐘讀數(shù)－分鐘讀數(shù)）四、品測定1．移取140微升緩沖液（Reagent）新的比色皿2．加入微升反應(yīng)液（Reagent）3．加入微升底物液（ReagentE）4．上下傾倒數(shù)次，勻5．在℃溫度下孵育3分6．加入微升待測樣品（500克蛋白意：7．上下傾倒數(shù)次，勻（限定在秒之內(nèi)）8．即刻放進(jìn)分光光儀檢測，此為樣品讀數(shù)（0分鐘讀數(shù)－鐘讀數(shù)）五、計(jì)算品活性[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)X樣品稀釋倍數(shù)X0.20（體系容量；毫）]÷[0.02樣品容量；毫升）X12.44（毫摩爾吸光系數(shù)）X10反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝位/毫升（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克單位＝微摩爾/分鐘六、標(biāo)儀測定1．在板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品2．分別移取140微升緩沖液C）96孔板里3．分別加入微升反應(yīng)液（ReagentD）4．分別加入微升底物液（ReagentE）5．輕輕搖動孔板6．在℃溫度下孵育3分7．分別加入微升陰性液F或待測樣品500微蛋白）到相應(yīng)孔里（注意樣品須清）8．輕輕搖動孔板9．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀測：0分鐘讀數(shù)和分鐘讀數(shù)10．活性計(jì)算：[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)X樣品稀釋倍數(shù)X0.20（體系容量；毫）]÷[0.02樣品容量；毫升）X12.44

（毫摩爾吸光系數(shù)）X0.6光徑距離；厘米X（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）]＝單位/毫升（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克單位＝微摩爾長/鐘注事1．本產(chǎn)品為次操作，包括背景對照2．操作時(shí)，須戴手3．建議使用微粒體品取代總蛋白樣品，避免干擾4．系統(tǒng)操作過程中背景測定只需次5．建議使用比色皿定6．樣品須澄清，至重要7．加樣后內(nèi)光度測定8．測定值由高到低化；測定持續(xù)鐘9．光度測定后，比皿須清洗徹底10．樣本測定0分鐘讀數(shù)高10分鐘讀數(shù)表明具有酶活性11．如果10分鐘讀數(shù)高于分鐘讀數(shù)，表明樣本沒有活性或檢測不到12．建議待測樣本白濃度為HL30030.1）

500微微升（本公司提供

蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－13．如果待測樣品度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度14．通常羥-3-甲二酰輔酶AHMG-COA）原酶活性很低，為皮摩爾級，吸光讀數(shù)差值微小15．如果樣本干擾大建議使用植物3-羥戊二酰輔酶AHMG-COA還原酶活性間接比色法