原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交

原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細胞雜交第1頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交本章主要內(nèi)容:第2頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三(1)了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義；(2)掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟；

(3)掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法；(4)掌握原生質(zhì)體融合的方湊。第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交本章教學目的與要求第3頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三

原生質(zhì)體（Protoplast）含義：去掉細胞壁的由質(zhì)膜包裹、具有生活力的裸露細胞。第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交第4頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三微絲葉綠體線粒體質(zhì)膜細胞核內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微管細胞壁高爾基體植物細胞模式圖第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交液泡第5頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化一、原生質(zhì)體分離雙子葉外植體胚性細胞第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交第6頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-----葉肉細胞。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化（一）材料來源禾本科植物：愈傷組織或懸浮細胞。第7頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化（二）分離方法機械分離法酶法分離法第8頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三1、機械分離法（Machanicalisolation）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化優(yōu)點：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點：

（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；

（2）方法繁瑣費力；

（3）局限性大第9頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三（1）酶的種類纖維素酶類（Cellulase）果膠酶類（Pectolyase）半纖維素酶類（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymaticisolation）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第10頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三（2）酶液的配制第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化滲透壓穩(wěn)定劑及pH酶的配比及濃度第11頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三（3）分離原生質(zhì)體第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化兩步分離法一步分離法方法有二：葉肉原生質(zhì)體分離提純第12頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三圖示原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化過濾、離心加果膠酶和纖維素酶第13頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化葉片愈傷組織第14頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三二、原生質(zhì)體純化與活力測定（一）原生質(zhì)體純化第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法第15頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三1、離心沉淀法原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過濾。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第16頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過濾。第二步：離心。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第17頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三3、界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第18頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三（二）原生質(zhì)體活力測定1、形態(tài)識別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識別1）0.1%酚番紅或Evans藍染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。第一節(jié)、原生質(zhì)體分離及純化第19頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交pH滲透壓鈣鎂生長物質(zhì)氮源碳源培養(yǎng)基第20頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三二、培養(yǎng)方法第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法第21頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三1、液體淺層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基2x105/ml第22頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三2、平板培養(yǎng)

原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37C左右）等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第23頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三3、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)）

培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第24頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法一：X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第25頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三方法二：X-射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.7%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)第二節(jié)、原生質(zhì)體培養(yǎng)第26頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三定義：原生質(zhì)體融合也叫做體細胞雜交，使分離出來的不同親本的原生質(zhì)體，在人工控制條件下，相互融合成一體，形成雜種細胞，并進一步發(fā)育成雜種植株的技術(shù)。第7章原生質(zhì)體培養(yǎng)與和體細胞雜交第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第27頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三一、原生質(zhì)體融合意義—克服雜交不親合—克服生殖器官敗育—克服柑桔多胚第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第28頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三二、融合方法

無機鹽誘導(dǎo)融合高pH-高Ca離子聚乙二醇(PEG)法

PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法電融合技術(shù)第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第29頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三(一)無機鹽誘導(dǎo)融合:

NaNO3法1972年：Carlson誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合獲得首例雜種植株粉藍煙草和朗氏煙草體細胞雜種。NaNO3的作用：中和質(zhì)膜的負電荷，使原生質(zhì)體不再相互排斥，而緊密結(jié)合在一起不足：誘導(dǎo)頻率不高。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第30頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三

1973年：Keller用pH10.5的50mMCaCl2溶液在37℃時，誘發(fā)煙草葉肉原生質(zhì)體融合。優(yōu)點：雜種產(chǎn)量高。不足：高pH值對細胞有毒害作用。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（二）高pH-高Ca離子法第31頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三PEG法特點：融合頻率高可重復(fù)性強誘發(fā)融合無特異性毒性較低植物+植物植物+動物動物+酵母第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（三）PEG法第32頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三PEG法原理PEG是一種帶負電性的高分子化合物，在原生質(zhì)體融合中起到一種橋梁作用，可以使原生質(zhì)體凝聚。在洗脫過程中，PEG將被洗掉，導(dǎo)致質(zhì)膜表面電荷重排。粘連的質(zhì)膜大面積緊密相連，電荷的重排隊導(dǎo)致一個原生質(zhì)體的負性電荷部位與另一原生質(zhì)體的正性電荷部位相連而導(dǎo)致融合。第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第33頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三最為常用。具體做法：在無菌條件下混合雙親原生質(zhì)體----滴加PEG溶液，搖勻，靜置---滴加高鈣-高pH溶液，搖勻，靜置---滴加原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗滌數(shù)次---離心獲得原生質(zhì)體細胞團---篩選---再生雜合細胞第三節(jié)、原生質(zhì)體融合（四）PEG結(jié)合高鈣-高pH誘導(dǎo)法第34頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三(五)電融合技術(shù)Senda1979年首先用此方法實現(xiàn)原生質(zhì)體融合第三節(jié)、原生質(zhì)體融合第35頁，共38頁，2023年，2月20日，星期三三、體細胞雜種細胞篩選與鑒定1．互補選擇法第三節(jié)、原生質(zhì)體融合2、機械分離