可見分光光度法和

可見分光光度法和第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

分光光度法是根據(jù)物質的吸收光譜及光的吸收定律，借助分光光度計對物質進行定性、定量分析的一種方法。根據(jù)測定時所用的光源波長的不同，分光光度法可分為可見分光光度法、紫外分光光度法和紅外分光光度法等幾種。

第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三可見分光光度法

（380－780nm)紫外分光光度法

（10－380nm)紅外分光光度法

（780－3×105nm)分光光度法第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

與滴定分析方法相比，分光光度法靈敏度高，被測物質濃度的下限可達到10-5~10-6mol?L-1，因而適用于微量及痕量成分含量的測定，是當前醫(yī)藥、衛(wèi)生、環(huán)保、化工等部門常用的分析方法之一。第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第一節(jié)基本原理一、光的性質與物質的顏色二、Lambert-Beer定律第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三一、光的性質與物質的顏色

當一束光照射在某物質或某溶液時，組成該物質的分子、原子或離子等粒子與光子作用獲得能量，從低能量狀態(tài)躍遷到高能量狀態(tài)，即由基態(tài)轉變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)，這個過程即是物質對光的吸收。

M(基態(tài))＋hν

→M*(激發(fā)態(tài)）第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

不同物質的基態(tài)和激發(fā)態(tài)的能量差不同，選擇吸收光子的能量也不同，即吸收光的波長不同。光的能量與波長成反比，波長越短，能量越高。第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

單一波長的光稱為單色光，由不同波長組成的光稱為復色光。白光（日光等）就是一種復色光，它是由紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色的光按一定的強度比例混合而成。若兩種顏色的光按照適當?shù)膹姸缺壤旌峡沙砂坠?，則這兩種光稱為互補色光。第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

處于同一直線上的兩種色光為互補光，見下圖：

從圖中可以看到，藍光與黃光互補，青光與紅光互補等第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

物質對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈現(xiàn)出吸收光的互補光的顏色。

如CuSO4溶液選擇性地吸收白光中間的黃色光，故CuSO4溶液呈藍色。

[Fe(SCN)6]3-呈血紅色，說明其溶液選擇性地吸收白光中的青色光。

如果溶液對所有顏色的光都不吸收，則溶液表現(xiàn)為無色透明；如溶液對所有顏色的光全部吸收，則溶液呈黑色。第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三物質呈現(xiàn)的顏色吸收光顏色波長范圍（nm)黃綠紫380－435黃藍435－480橙黃綠藍480－500紅紫綠500－560紫黃綠560－580藍黃580－595綠藍橙595－650藍綠紅650－760第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)分光光度法基本原理一、透光率和吸光度二、Lambert-Beer定律第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、Lambert-Beer定律（一）透光率和吸光度IoItb有色溶液

當一束平行的單色光照射到有色溶液時，一部分光被溶液吸收，剩余部分則透過溶液。第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

若入射光的強度為Io，透過光的強度為It，則透射光的強度It與入射光強度Io之比稱為透光率，用T表示：

透光率越大，溶液對光的吸收越少；反之，透光率越小，溶液對光的吸收越多。第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

透光率的負對數(shù)稱為吸光度，用A表示。A越大，溶液對光的吸收越多。

第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（二）Lambert-Beer定律

溶液對光的吸收除與溶液的本性有關外，還與入射光波長、溶液濃度、液層厚度和溶液溫度等因素有關，它們之間的關系符合以下數(shù)學公式：A=kbc當一束平行的單色光通過均勻的某溶液時，溶液的吸光度與溶液的組成標度和液層厚度的乘積成正比，這一定律稱為Lambert-Beer定律，又稱為光吸收定律。第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三注意：

使用Lambert-Beer定律有兩個限制條件：單色光和稀溶液。第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

1.摩爾吸光系數(shù)

b：液層厚度（cm）

c：溶液物質的量濃度（mol·L-1）

ε：摩爾吸光系數(shù)（L·mol-1·cm-1）

第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

若用質量濃度ρ(g·L-1)代替物質的量濃度c，則上述公式可表示為：

a：質量吸光系數(shù)（L·g-1·cm-1）2.質量吸光系數(shù)第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

a和ε可通過下式轉換：

M表示被測物質的摩爾質量

ε或a的數(shù)值越大，表明溶液對入射光越容易吸收，測定的靈敏度就越高。一般ε值大于103即可進行分光光度法測定。

第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三由Lambert-Beer定律可知：第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

P96【例10-1】某化合物的相對分子質量為251，用乙醇溶劑配成濃度為0.150mmol·L－1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8％，求該化合物的ε和a

。第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三解：由Lambert-Beer定律可得第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三例：M＝250（g·mol-1）的某物質，ε（λmax）5.0×104L·mol-1·cm-1，若將原溶液稀釋10倍，于1.00cm吸收池中測得A＝0.40，問原溶液的質量濃度（mg·L-1）為多少？第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三解第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

三、單色光的選擇

入射單色光的波長，可通過制作吸收光譜選擇：將不同波長的單色光依次通過某一固定濃度的有色溶液，測定相應的吸光度A，以波長λ為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，可得一曲線，此曲線就是吸收光譜或吸收曲線。第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三以KMnO4溶液的吸收光譜圖為例，看看它的吸收光譜：

KMnO4溶液的吸收光譜λmax=525nm，說明溶液最容易吸收波長為525nm附近的光，因此，它的入射單色光的波長選定為525nm。第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三溶液對不同波長的光吸收程度是不同的，最大吸光度對應的波長稱為最大吸收波長，用λmax

表示。λmax表示溶液對該波長的光最容易吸收，吸收程度最大，在此波長下測定吸光度，靈敏度最高，此λmax

也就是所要選擇的入射單色光的波長。

第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第二節(jié)比色分析的方法和儀器一、分光光度計二、測定方法第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

可見分光光度法是以可見光作光源，經(jīng)單色器分光后，以所需波長的單色光作入射光，通過測定溶液的吸光度來計算溶液中被測物質含量的一種分析方法，所用的儀器稱為分光光度計。第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

一、分光光度計

光源單色器

吸收池檢測器信號處理及顯示器第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

1、光源可見分光光度計是以鎢燈作光源。鎢燈可發(fā)出320至3200nm的連續(xù)光譜，波長最適宜的波長范圍為360至1000nm。2、單色光器單色光器由棱鏡或光柵、狹縫和準直鏡等部分組成。通過轉動棱鏡便可在出光狹縫得到所需波長的單色光。第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三所以混合光從空氣進入棱鏡后，便按波長由長到短的順序依次分散成為一個連續(xù)光源。單色光器的作用就是將混合光分散成一系列的單色光。白光在棱鏡中的色散第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

3、吸收池分光光度計中用來盛放溶液的容器稱為吸收池又稱為比色皿，是用光學玻璃制成。在測定中同時配套使用的吸收池應相匹配，即有相同的厚度和相同的透光性。4、檢測器可見分光光度計中的檢測器一般用（光電池或）光電管，它是用一個陽極和一個對光敏感材料制成的陰極所組成的真空二級管，當光照射到陰極時，表面金屬發(fā)射電子，流向電勢較高的陽極而產(chǎn)生電流。第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

5、顯示器光電管輸出的電訊號很弱，約為1×10－6A，經(jīng)放大器放大后輸入顯示器。顯示器一般有微安電表，記錄器，數(shù)字顯示和打印等。透光率刻度是等分的，因吸光度與透光率是負對數(shù)關系，所以吸光度刻度是不均等的。吸光度和透光率標尺第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

721型分光光度計光學系統(tǒng)示意圖1．光源；2,8．聚光透鏡；3．棱鏡；4．準直鏡；5,11．保護玻璃；6．狹縫；7．平面反射鏡；9．吸收池；10．光門；12．光電管第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三二、測定方法（一）標準曲線法（二）標準對照法第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（一）標準曲線法

測定步驟：（1）配制標準系列：用標準樣品配制一系列不同濃度的標準溶液（稱為標準系列）。（2）測定標準系列的吸光度A：將標準系列置于一定規(guī)格的比色皿中，在一定波長（λmax

）下，測定其相應的吸光度A值。（3）繪制標準曲線：以溶液的濃度為橫坐標，相應的A值為縱坐標作圖，得到一條通過坐標原點的直線——

標準曲線。第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（4）樣品含量的測定：用相同的方法，在相同的條件下測定樣品溶液的A值，然后在標準曲線上找到該A值，其對應的濃度數(shù)值即為樣品溶液的濃度。00.20.40.60.811.2050100150200A維生素B12的標準曲線第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三（二）標準對照法

先配制一個與被測溶液濃度相近的標準溶液（其濃度用cs表示），在處測出吸光度As

，在相同條件下測出試樣溶液的吸光度Ax

，則試樣溶液的濃度cx

可按照下式求得：此法適用于非經(jīng)常性的分析工作。第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三第四節(jié)比色分析－鐵的測定1、鄰二氮菲法2、硫氰酸鹽法3、磺基水楊酸法第42頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三1、鄰二氮菲法

Fe2+與鄰二氮菲反應生成紅色螯合物：

第43頁，共45頁，2023年，2月20日，星期三

在控制溶液的pH＝5～6時顯色，其它共存離子不干擾。當F