原位分子雜交組織化學(xué)

原位分子雜交組織化學(xué)第1頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三一、概念

用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織、細(xì)胞中待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后再用與標(biāo)記物對(duì)應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在核酸原有位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。第2頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三二、原位雜交的基本原理第3頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三三、原位雜交組織化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用1.細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄的定位；2.癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)及其變化的研究；

3.病原微生物檢測(cè)；4.基因在染色體上的定位；5.檢測(cè)染色體的變化；6.分裂間期細(xì)胞遺傳學(xué)的研究。第4頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三四、核酸探針的種類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同

DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針、寡核苷酸探針根據(jù)探針的標(biāo)記方法不同放射性探針：32P、3H、35S

非放射性探針：生物素標(biāo)記地高辛標(biāo)記熒光標(biāo)記第5頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三DNA探針1.克隆在質(zhì)粒載體中，可以無(wú)限增殖，制備簡(jiǎn)便。2.不易降解。標(biāo)記的方法較成熟多樣（切口平移等）cDNA探針1.互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。2.逆轉(zhuǎn)錄合成，不含內(nèi)含子序列，適宜基因表達(dá)的檢測(cè)。單鏈比雙鏈靈敏度高，且不需變性，使能與靶mRNA結(jié)合的探針濃度提高。第6頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三cRNA探針單鏈分子，雜交反應(yīng)效率高?？煽刂妻D(zhuǎn)錄方向，得到同義RNA探針（與mRNA同序列），或反義RNA探針（cRNA，與mRNA互補(bǔ)）。可檢測(cè)DNA和mRNA，還可觀察基因的轉(zhuǎn)錄狀況。易于降解，標(biāo)記方法復(fù)雜。寡核苷酸探針鏈短、分子量小、序列復(fù)雜度低，雜交時(shí)間比克隆探針短。可識(shí)別靶序列中一個(gè)堿基的變化，故成套探針用于堿基點(diǎn)突變的檢測(cè)。一次可大量合成，價(jià)格低廉，易于標(biāo)記。缺點(diǎn)：與克隆探針比較，特異性差，雜交信號(hào)弱。第7頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三設(shè)計(jì)篩選寡核苷酸探針的原則長(zhǎng)30-50bp，長(zhǎng)探針則雜交時(shí)間長(zhǎng)，短則特異性差。堿基成分：G＋C含量為40%-60%。探針?lè)肿觾?nèi)不能有互補(bǔ)區(qū)。第8頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三探針?lè)N類優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)cDNA1.制備簡(jiǎn)單2.放射比活性高3.信號(hào)特異性強(qiáng)

4.雜交體較穩(wěn)定1.變性后才能使用2.要基因克隆3.組織穿透力差4.易于退火cRNA

1.信號(hào)特異性強(qiáng)2.不需變性3.雜交后可用RNase除去未雜交的探針4.雜交體非常穩(wěn)定5.不會(huì)退火

1.易被Rnase降解2.易吸附于器皿上3.組織穿透力差4.需做亞克隆寡聚核苷酸1.易制備2.使用方便3.組織穿透力強(qiáng)4.不需做克隆

5.不會(huì)退火6.只要知道氨基酸順序便可制備探針1.需核酸合成儀2.需明確mRNA順序3.單堿基錯(cuò)誤將影響雜交4.雜交體不太穩(wěn)定

第9頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五.探針標(biāo)記

探針的標(biāo)記物分為放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記兩大類：放射性標(biāo)記物一般為125I、35S或32P；非放射性標(biāo)記有生物素或地高辛的間接標(biāo)記，也有FITC或者羅丹明對(duì)探針?lè)肿拥闹苯訕?biāo)記。第10頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三探針標(biāo)記方法比較敏感性：放射性探針＞地高辛探針＞生物素探針對(duì)人危害性：放射性探針、生物素探針?lè)派湫蕴结樖馨胨テ谙拗疲豢砷L(zhǎng)期保存。生物素探針受內(nèi)源性生物素影響，可致假陽(yáng)性；地高辛探針則顯色復(fù)雜。

第11頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三探針標(biāo)記方法

探針標(biāo)記方法很多，大致分為：引入法和化學(xué)修飾法。*引入法：運(yùn)用標(biāo)記好的核苷酸來(lái)合成探針；*化學(xué)修飾法：采用化學(xué)方法將標(biāo)記物摻入已合成的探針?lè)肿又腥?，或改變探針原有的結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生特定的化學(xué)基團(tuán)。第12頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三引入法較化學(xué)修飾法更常用，按其整合的方法不同，引入法分為：*缺口平移法*隨機(jī)引物法*末端標(biāo)記法*PCR擴(kuò)增標(biāo)記法*RNA體外轉(zhuǎn)錄法第13頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三缺口平移法

原理：利用DNA酶I在雙鏈DNA的各股單鏈的不同位置上造成隨機(jī)切口，再利用大腸桿菌DNA聚合酶進(jìn)行5’→3’修復(fù)，將已標(biāo)記dNTP摻入到新合成的DNA鏈中。第14頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三隨機(jī)引物法原理：將長(zhǎng)6個(gè)核苷酸的寡核苷酸片段（隨機(jī)引物）與單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合（退火），在引物的3‘羥基末端逐個(gè)加上核苷酸直至下一個(gè)引物，即形成標(biāo)記的DNA探針。第15頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

末端標(biāo)記法

原理：將標(biāo)記物導(dǎo)入線性DNA或RNA的5’端或3’端的一類標(biāo)記方法。主要分為：5’末端標(biāo)記法，3’末端標(biāo)記法，T4聚合酶替代法。第16頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三五、ISHH基本程序（以檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)的mRNA為例）(一）雜交前處理玻片預(yù)處理（滅活Rnase)切片處理（增強(qiáng)組織通透性和探針穿透性）第17頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

1.玻片預(yù)處理（滅活Rnase)

玻片置于熱肥皂水浸泡4小時(shí)以上自來(lái)水清洗干凈置于酸缸中浸泡過(guò)夜清水洗凈烘干烘箱溫度最好在150℃或以上烤干4小時(shí)以上。以去除任何RNA酶.蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理,錫箔紙包裹無(wú)塵存放.

粘附劑:常用的粘附劑多聚賴氨酸溶液。第18頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

2.切片處理：增強(qiáng)組織通透性和探針穿透性1）充分脫蠟2）防止探針與組織中堿性蛋白靜電結(jié)合，降低背景稀酸處理（0.2mol/lHCL10min）乙?；?.25%乙酸酐10min）第19頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三3）去污劑：增加組織通透性，利于探針進(jìn)入0.01%-0.3%TritonX-10015min4）酶消化：使經(jīng)固定后被遮蔽的靶核酸暴露

蛋白酶K、鏈酶蛋白酶、胃蛋白酶1ug/ml蛋白酶K，37℃，15-30min

5）雜交緩沖液孵育：阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)第20頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

3.防止RNA酶的污染

由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃皿上均可能有RNA酶,為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套.所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫(160℃)烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的.要破壞RNA酶,其最低溫度必需在150℃左右.

第21頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三（二）雜交反應(yīng)：

將雜交液滴于經(jīng)預(yù)雜交處理的組織細(xì)胞切片上，加蓋硅化的蓋玻片，按所要求的溫度進(jìn)行的孵化。第22頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

雜交液

1）一定濃度的探針2）高濃度Na+:使雜交率增加，減少靜電結(jié)合3）硫酸葡聚糖：10%硫酸葡聚糖，形成探針混合液基質(zhì)，對(duì)DNA有濃縮作用，可提高雜交的反應(yīng)速度10倍以上，但不影響探針的洗脫強(qiáng)度；雜交時(shí)常用濃度為5%～10%，但濃度高時(shí)會(huì)使溶液的粘度增大，不利雜交探針的滲透。4）牛血清白蛋白、載體DNA或RNA：阻斷非特異性結(jié)合，降低背景。第23頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

探針濃度：以最低濃度達(dá)到與靶核酸的最大飽和結(jié)合度0.5-5.0ug/ml，10-20ul/片雜交時(shí)間：

一般為16~20小時(shí)雜交嚴(yán)格度：

反應(yīng)體系中避免非同源性或只有部分同源性的核酸順序形成雜交復(fù)合物的條件。低雜交溫度、低甲酰胺的濃度、高離子強(qiáng)度條件下，嚴(yán)格度低，反之嚴(yán)格度高。嚴(yán)格度愈高，雜交反應(yīng)特異性愈強(qiáng)，但敏感性愈低。第24頁(yè)，共26頁(yè)，2023年，2月20日，星期三

(三）雜交后處理

目的：除去未參與雜交體形成的過(guò)余探針，除去探針與組織標(biāo)本之間的非特異