雙水相萃取的原理及應(yīng)用

雙水相萃取的原理及應(yīng)用第1頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四組員:NF-κB信號(hào)通路劉文榮王嘉犀范倩何亞玲第2頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四英英釋義內(nèi)容Content1、雙水相萃取的歷史2.雙水相萃取的基本原理3.雙水相萃取的特點(diǎn)4.雙水相萃取的應(yīng)用第3頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：Beijerinck（？？-）早在1896年,Beijerinck發(fā)現(xiàn),當(dāng)明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液相混時(shí),得到一個(gè)混濁不透明的溶液，隨之分為兩相,上相富含明膠,下相富含瓊脂(或淀粉),這種現(xiàn)象被稱為聚合物的不相溶性，從而產(chǎn)生了雙水相體系(Aqueoustwophasesystem,ATPS)。第4頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：1956年瑞典lund大學(xué)的Albertsson教授及其同事開始對(duì)雙水相系統(tǒng)進(jìn)行比較系統(tǒng)研究。測(cè)定了許多雙水相系統(tǒng)的相圖，為雙水相萃取系統(tǒng)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。只局限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的測(cè)定和理論研究。第5頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：Kula教授研究小組對(duì)雙水相的應(yīng)用、工藝流程、操作參數(shù)、工程設(shè)備、成本分析等進(jìn)行了大量研究，在應(yīng)用上獲得成功。1978年首先將雙水相萃取技術(shù)用于酶的大規(guī)模分離純化。第6頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的歷史：ATPE的歷史：雙水相萃取可分離多肽、蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒、細(xì)胞、細(xì)胞器、細(xì)胞組織，以及重金屬離子等，近年來(lái)，還應(yīng)用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應(yīng)系統(tǒng)用于酶反應(yīng)，生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵的產(chǎn)物生產(chǎn)與分離的集成。第7頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理

萃?。豪梦镔|(zhì)在兩種互不混溶的溶劑中的分配差異進(jìn)行分離的技術(shù)。

有機(jī)溶劑萃?。阂耘c水互不相溶的有機(jī)溶劑作萃取劑從水相中萃取目的產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于抗生素、有機(jī)酸、維生素等發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)。用于蛋白質(zhì)、核酸、酶等生物大分子的分離很少成功。

反萃?。菏褂盟芤簭挠袡C(jī)溶劑中萃取水溶性的物質(zhì)。第8頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理反膠團(tuán)萃?。豪帽砻婊钚詣┰谟袡C(jī)相中形成的反膠團(tuán)（reversedmicelles），從而在有機(jī)相內(nèi)形成分散的親水微環(huán)境。第9頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理反膠團(tuán)萃?。菏股锓肿釉谟袡C(jī)相（萃取相）內(nèi)存在于反膠團(tuán)的親水微環(huán)境中，消除了生物分子，特別是蛋白質(zhì)類生物活性物質(zhì)難于溶解在有機(jī)相中或在有機(jī)相中發(fā)生不可逆變性的現(xiàn)象。

超臨界萃?。旱?0頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理以上方法對(duì)蛋白質(zhì)的分離純化有不同的缺陷。第11頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理到目前為止，雙水相技術(shù)幾乎在所有的生物物質(zhì)如:氨基酸、多肽、核酸、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、各類細(xì)胞、病毒等的分離純化中得到應(yīng)用,特別是成功地應(yīng)用在蛋白質(zhì)的大規(guī)模分離中。第12頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理雙水相萃取與水-有機(jī)相萃取的原理相似,都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。第13頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理當(dāng)萃取體系的性質(zhì)不同時(shí),物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后,由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等)的存在和環(huán)境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。第14頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理:ATPE的基本原理第15頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理高聚物/高聚物體系：聚乙二醇(簡(jiǎn)稱PEG)/葡聚糖(簡(jiǎn)稱Dextran)高聚物/無(wú)機(jī)鹽體系：硫酸鹽體系。常見的高聚物/無(wú)機(jī)鹽體系為:PEG/硫酸鹽或磷酸鹽體系。第16頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理PEG=聚已二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)第17頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四常用的雙水相體系:ATPE的基本原理PEG/Dx體系一般用于小規(guī)模地分離生物大分子、膜、細(xì)胞等，PEG/無(wú)機(jī)鹽體系主要用來(lái)大規(guī)模地提純酶，這是因?yàn)镻EG/無(wú)機(jī)鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價(jià)格昂貴的緣故。第18頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理類型形成上相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物/非離子型聚合物聚乙二醇葡聚糖聚乙烯醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙烯吡咯烷酮高分子電解質(zhì)/非離子型聚合物羧甲基纖維素鈉聚乙二醇高分子電解質(zhì)/高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉聚合物/低分子量化合物葡聚糖丙醇聚合物/無(wú)機(jī)鹽聚乙二醇磷酸鉀硫酸銨各種類型的雙水相體系第19頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時(shí)物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理第20頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時(shí)物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理雙節(jié)線(bi-nodal)：圖中的曲線。雙節(jié)線以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū),以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，即ATPS。系線(tieline)：雙節(jié)線上連兩點(diǎn)的直線。K點(diǎn)：K點(diǎn)為臨界點(diǎn)，表示兩相差別消失。第21頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四相圖:相平衡時(shí)物系的組成,溫度與壓力的關(guān)系A(chǔ)TPE的基本原理系線反映的信息

杠桿規(guī)則：系線上各點(diǎn)均為分成組成相同，而體積不同的兩相。兩相體積近似服從杠桿規(guī)則

性質(zhì)差異：系線的長(zhǎng)度是衡量?jī)上嚅g相對(duì)差別的尺度,系線越長(zhǎng),兩相間的性質(zhì)差別越大；反之則越小.第22頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理第23頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理聚合物分子量的影響：

對(duì)于給定的相系統(tǒng)，如果一種高聚物被低分子量的同種高聚物所代替，被萃取的大分子物質(zhì),如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞粒子等，將有利于在低分子量高聚物一側(cè)分配。第24頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理聚合物分子量的影響：

如以Dextran500(MW500000)代替Dextran40（MW40000）,即增大下相高聚物的分子量，被萃取的低分子量物質(zhì)如細(xì)胞色素C分配系數(shù)增加并不顯著。然而，被萃取的大分子量物質(zhì)，如過(guò)氧化氫酶的分配系數(shù)可增大到原來(lái)的6~7倍。第25頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理pH值的影響：改變兩相的電位差如體系pH值與蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)相差越大，則蛋白質(zhì)在兩相中分配越不均勻。pH值的變化也會(huì)影響磷酸鹽的離解程度，導(dǎo)致組成體系的物質(zhì)電性發(fā)生變化，也會(huì)使被分離物質(zhì)的電荷發(fā)生改變，從而影響分配的進(jìn)行。第26頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理離子環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)在兩相體系分配的影響:

在雙水相聚合物系統(tǒng)中，加入電解質(zhì)時(shí)，其陰陽(yáng)離子在兩相間會(huì)有不同的分配。

同時(shí)，由于電中性的約束,存在一穿過(guò)相界面的電勢(shì)差(Donnan電勢(shì)),它是影響荷電大分子，如蛋白質(zhì)和核酸等分配的主要因素。第27頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四影響雙水相萃取的因素ATPE的基本原理例如，DNA萃取時(shí)，離子組分微小的變化可使DNA從一相幾乎完全轉(zhuǎn)移到另一相。第28頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理離子液體BmimPF6直接萃取DNA第29頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理基于離子液體BmimPF6的雙水相體系直接萃取牛血清蛋白。第30頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點(diǎn)ATPE的特點(diǎn)對(duì)生物物質(zhì)、天然產(chǎn)物、抗生素等的提取、純化方面的優(yōu)勢(shì)：

(1)含水量高(70％~90％)，在接近生理環(huán)境的體系中進(jìn)行萃取，避免生物活性物質(zhì)失活或變性。

(2)可以直接從含有菌體的發(fā)酵液和培養(yǎng)液中提取所需的蛋白質(zhì)（或酶），可直接提取細(xì)胞內(nèi)酶，避免破碎或過(guò)濾等步驟。

第31頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點(diǎn)ATPE的基本原理

(3)分相時(shí)間短，自然分相時(shí)間一般為5min～15min。

(4)界面張力小(10-7～10-4mN／m)，利于兩相之間的質(zhì)量傳遞。(5)不存在有機(jī)溶劑殘留問(wèn)題，高聚物不易揮發(fā)，對(duì)人體無(wú)害。

第32頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點(diǎn)ATPE的基本原理(6)大量雜質(zhì)可與固體物質(zhì)一同除去。

(7)易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無(wú)需進(jìn)行特殊處理。

(8)操作條件溫和，在常溫常壓下進(jìn)行。

(9)親和雙水相萃取技術(shù)可以提高分配系數(shù)和萃取的選擇性。

第33頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點(diǎn)ATPE的基本原理雖然該技術(shù)在應(yīng)用方面已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但幾乎都是建立在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，到目前為止還沒(méi)能完全清楚地從理論上解釋雙水相系統(tǒng)的形成機(jī)理以及生物分子在系統(tǒng)中的分配機(jī)理。

第34頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相的特點(diǎn)ATPE的基本原理不足之處:如易乳化、成相聚合物的成本較高、分離效率不高等,

第35頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的基本原理雙水相系統(tǒng)平衡時(shí)間短，含水量高，界面張力低，為生物活性物質(zhì)提供了溫和的分離環(huán)境。它還具備操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)省時(shí)、易于放大。據(jù)報(bào)道，系統(tǒng)可從10ml直接放大到1m3規(guī)模（105倍）,而各種試驗(yàn)參數(shù)均可按比例放大，產(chǎn)物收率并不降低。

第36頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的基本原理英英釋義1、蛋白質(zhì)、酶的純化2、多肽的分離純化3、核酸的分離純化4、其它分離純化第37頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的基本原理主要是分離蛋白質(zhì)，酶，病毒，脊髓病毒和線病毒的純化，核酸，DNA的分離，干擾素，細(xì)胞組織，抗生素，多糖，色素，抗體等。第38頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的基本原理1)蛋白質(zhì)、酶的純化2)多肽的分離純化

第39頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的基本原理目前，用此法來(lái)提純的酶已達(dá)數(shù)十種，其分離過(guò)程也達(dá)到相當(dāng)規(guī)模，I-HorngPan等人利用PEG1500/NaH2PO4體系從Trichodermakoningii發(fā)酵液中分離純化β-木糖苷酶，該酶主要分配在下相，下相酶活回收率96.3%，純化倍數(shù)33。

第40頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說(shuō)明雙水相分離過(guò)程的原則流程:包括三步雙水相分離,第一步：所選擇的條件應(yīng)使蛋白質(zhì)產(chǎn)物分配在富PEG的上相中,而細(xì)胞碎片及雜質(zhì)蛋白質(zhì)等進(jìn)入下相。第41頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說(shuō)明雙水相分離過(guò)程的原則流程:包括三步雙水相分離,第二步：分相后上相中再加入鹽使再次形成雙水相體系,核酸和多糖則分配入富鹽的下相,雜質(zhì)、蛋白質(zhì)也進(jìn)入下相,而所需的蛋白質(zhì)再次進(jìn)入富含PEG的上相。第42頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的基本原理以蛋白質(zhì)的分離為例說(shuō)明雙水相分離過(guò)程的原則流程:第三步：向分相后的上相中加入鹽以再一次形成雙水相體系。在這一步中,要使得蛋白質(zhì)進(jìn)入富鹽的下相,以與大量的PEG分開。蛋白質(zhì)與鹽及PEG的分離可以用超濾、層析、離心等技術(shù)。第43頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用第44頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的應(yīng)用雙水相萃取的應(yīng)用第45頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用3)核酸的分離純化

第46頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的應(yīng)用4)病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞的分離

第47頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四ATPE的應(yīng)用4)病毒、細(xì)胞器、細(xì)胞的分離

第48頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取

甘草、銀杏液、黃芩苷等的有效成分分離。

謝濤等利用PEG4000/K2HPO4組成的雙水相體系從三七中萃取三七皂苷,回收率為96%。

第49頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取(1)將PEG和K2HPO4配成一定濃度的濃溶液;

(2)在常溫下,取三七濃縮液置于10ml的離心試管中,加入一定體積的成相物質(zhì)濃溶液,振蕩搖勻,在離心機(jī)中以一定轉(zhuǎn)速離心5min,使其分相;

第50頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取(3)分別讀取上下相體積,并取樣分析上下相中三七總皂苷的含量。

第51頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取

第52頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取

第53頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用5）中草藥成分的提取

第54頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用6）雙水相萃取分析黃毒苷的免疫測(cè)定第55頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用7）稀有金屬/貴金屬分離克服溶劑萃取法的不足。在聚乙二醇2000/硫酸按/偶氮胂（shen四聲）(Ⅲ)雙水相體系中,實(shí)現(xiàn)了Ti(Ⅳ)與Zr（鋯gao）(Ⅳ)的分離

第56頁(yè)，共62頁(yè)，2023年，2月20日，星期四雙水相萃取的應(yīng)用ATPE的應(yīng)用7）稀有金屬/貴金屬分離

分別在60ml分液漏斗中加入不同pH值的緩沖溶液2ml,偶氮胂Ⅲ溶液0.