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實驗五、農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化

實驗?zāi)康模簩W習農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化原理。實驗要求：掌握農(nóng)桿菌的特點及真核表達載體結(jié)構(gòu)及應(yīng)用。技術(shù)應(yīng)用：高等植物（雙子葉植物或單子葉植物）轉(zhuǎn)基因鑒定基因功能

，包括過表達（誘導型或組成型），RNAi等。實驗材料：農(nóng)桿菌GV3101菌株，重組雙元表達載體pCAMBIA1300試劑：YEB液體培養(yǎng)基（液體和固體），Kan（卡那霉素），Rif（利福平）；CaCl2(預(yù)冷)；NaCl；50%無菌甘油

。實驗原理：

1.農(nóng)桿菌簡介：第一例轉(zhuǎn)基因植物就是用農(nóng)桿菌介導法完成的。菌種：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌，二者均屬革蘭氏陰性菌，對雙子葉植物侵染廣泛，在某些條件下對單子葉植物也有一定的感染性。雙元表達載體雙元表達載體中Ti質(zhì)粒pCAMBIA1300的結(jié)構(gòu)⑴挑取農(nóng)桿菌GV3101單菌落接種于3ml的新鮮YEB（無抗）液體培養(yǎng)基中，28℃200r/mim振蕩培養(yǎng)過夜；⑵按1：100的比例接種于50mlYEB（利福平Rif125mg/L）的培養(yǎng)基中擴培，28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600=0.4-0.6。將菌液置于冰上30min；⑶取1.4ml菌液，5,000rpm，4℃離心5min，棄上清，將菌體懸浮于1.0ml（預(yù)冷）0.15mol/LNaCl中。⑷5,000rpm,4℃離心5min，棄上清；⑸菌體用120μl預(yù)冷的20mmol/LCaCl2（4℃）輕輕懸浮細胞，之后加80μl50%無菌甘油，無菌甘油的終濃度為20%，液氮中速凍1

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