微生物分離培養(yǎng)

微生物分離培養(yǎng)第1頁/共18頁MixedcultureSeparationofsingleculturesPureculture研究思路CellCycleInhibitionApoptosisNecrosisP388.K562CellsbioactivemicrobeDereplication第1頁/共17頁第2頁/共18頁CultivationOptimizationActiveAxtractCC,PTLC,PHPLCSephadexLH20IR,UV,MS,NMRCD,ORD,X-RayBioactivityReassayEvaluationofanticanceractivitiesFromMicrobeHosttoStructure第2頁/共17頁第3頁/共18頁微生物分離篩選路線樣品稀釋平板涂布

平板劃線純化斜面保藏預(yù)處理選擇性培養(yǎng)基第3頁/共17頁第4頁/共18頁·初篩（5ml液體試管培養(yǎng)）復(fù)篩（100ml三角瓶培養(yǎng)）菌株照相（菌落形態(tài)、顯微形態(tài)）代謝產(chǎn)物指紋圖譜（TLC、HPLC）保藏（斜面一支，砂土兩支，甘油四支，大發(fā)酵菌株發(fā)酵種子液甘油管兩支）菌株登記菌株第4頁/共17頁第5頁/共18頁菌株編號分離菌株時(shí)格式：樣品編號+兩位序號（如從SY01樣品中分離的菌株，編號依次為SY01-01,SY01-02等）活性菌株編號由四部分組成：單位+研究室+分離人姓名首字母+序號組成（如QD-NP-ABC-01）?；钚院Y選工作結(jié)束后，上交活性菌株（斜面、砂土、甘油）、活性菌株浸膏、薄層照片、HPLC指紋圖譜、微生物培養(yǎng)形態(tài)、顯微形態(tài)照片，分離的活性菌株詳細(xì)填寫菌株登記表（Access表格）。第5頁/共17頁第6頁/共18頁倒制平板①將融化的瓊脂培養(yǎng)基，冷卻至50℃左右。②在酒精燈火焰旁，以右手的無名指、小指夾持棉塞，左手掀開皿蓋。右手持三角瓶向皿內(nèi)注入培養(yǎng)基。③將培養(yǎng)皿稍加以旋轉(zhuǎn)搖動后，置于水平位置待凝。第6頁/共17頁第7頁/共18頁稀釋第7頁/共17頁第8頁/共18頁①將菌種用無菌水制成懸液。②取若干只無菌試管，每只內(nèi)盛9ml無菌水。③吸取上述菌懸液lml加入第1只含有無菌水的試管內(nèi)。這樣就使第1只試管細(xì)菌濃度為原菌懸液的l/lO，也就是10-1。④從第1只試管內(nèi)(10-1)吸取lml注入第2只含有無菌水的試管內(nèi)，這樣試管內(nèi)的細(xì)菌濃度為原菌懸液的1/100，也就是10-2。⑤用同樣方法，制成10-3～10-8的菌懸液。第8頁/共17頁第9頁/共18頁涂布第9頁/共17頁第10頁/共18頁斜面接種第10頁/共17頁第11頁/共18頁①操作前，先用75％乙醇擦手，待乙醇揮發(fā)后才能點(diǎn)燃酒精燈。②將斜面菌種管和欲接種的斜面試管同時(shí)拿在左手的大拇指和其它四指之間，長有菌苔的一面向上，并處于水平位置。③先將菌種管和試管的棉塞旋松，便于接種時(shí)取出。④右手拿接種環(huán)，與通常拿筆一樣。將要伸入管內(nèi)部分的金屬柄和金屬絲在酒精燈焰上灼燒滅菌。⑤用右手小指、無名指及手掌將菌種管和試管的棉塞同時(shí)拔出，并把棉塞握住，不隨意放在桌上或與其它物品相接觸，再以火焰燒管口。⑥將上述在火焰上滅菌過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，接取菌種前先在管內(nèi)壁上或未長苔的培養(yǎng)基面上接觸一下，使接種環(huán)充分冷卻，以免燙死菌種。用接種環(huán)輕輕刮取少許苔后，自菌種管內(nèi)抽出。抽出時(shí)勿與管壁相碰，也勿再通過火焰。迅速將沾有菌種的接環(huán)伸入待接種的斜面培養(yǎng)基試管內(nèi)，由里到外劃折線，使菌體粘附于培養(yǎng)基上。劃線時(shí)，勿用力劃破培養(yǎng)基。⑦接種完畢后將接種環(huán)抽出，灼燒管口，塞上棉塞。加棉塞時(shí)，不要用試管口去迎塞，以免試管在移動時(shí)污染雜菌。⑧接種環(huán)在放回原位前，要經(jīng)火焰灼燒滅菌。第11頁/共17頁第12頁/共18頁①在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)，待冷卻，取一環(huán)菌液。②左手握住瓊脂平板，用大拇指和食指稍抬起皿蓋，同時(shí)靠近火焰周圍，右手持接種環(huán)伸入皿內(nèi)，在平板上一個(gè)區(qū)域作“之”形來回劃線。劃線時(shí)使接種環(huán)與平板表面成30o～40o角輕輕接觸，以腕力在表面作較快的滑動，勿使平板表面劃破或嵌進(jìn)培養(yǎng)基內(nèi)。③灼燒接種環(huán)，冷卻后，再將平皿轉(zhuǎn)動一定的角度，接種環(huán)通過劃過線的區(qū)域，在第二區(qū)域繼續(xù)劃線。④劃后再灼燒接種環(huán)，冷卻后用同樣的方法在其它區(qū)劃線。⑤全部劃線完畢后，在平皿底注明菌種、姓名和日期等。將培養(yǎng)皿倒置放入恒溫箱培養(yǎng)。⑥適當(dāng)溫度培養(yǎng)一段時(shí)間后，取出觀察。

平板劃線第12頁/共17頁第13頁/共18頁第13頁/共17頁第14頁/共18頁newmarinegenusSalinisporatropicaMarinisporasp.第14頁/共17頁第15頁/共18頁第15頁/共17頁第16頁/共18頁

檢查冷凝桶內(nèi)水位是否高于最