基因工程原理及實驗技術

基因工程原理及實驗技術第1頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第一章基因工程的概論第一節(jié)基因工程的概念

一、基因工程的基本概念

狹義基因工程

廣義基因工程第2頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四狹義基因工程

狹義的基因工程(geneengineering):

從狹義上講，基因工程是指將一種或多種生物體(供體)的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另—種生物體(受體)內(nèi)．使之按照人們的意愿遺傳并表達出新的性狀。因此，供體、受休、載體稱為基因工程的三大要素。第3頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四狹義基因工程

狹義的基因工程:就是重組DNA技術（recombinantDNAtechniques）1）重組DNA技術

（recombinantDNAtechniques)2）分子克?。╩olecularcloning)3）基因克隆（genecloning)4）遺傳操作(geneticmanipulation）5）遺傳工程(geneticengineering)6）基因工程(geneengineering)第4頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四廣義基因工程廣義的基因工程：是指DNA重組技術的產(chǎn)業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是外源基因重組、克隆、表達的設計與構建(即狹義的基因工程)；下游技術則涉及含有重組外源基因的生物細胞(基因工程菌或細胞)的大規(guī)模培養(yǎng)以及外源基因的表達、產(chǎn)物的分離、純化過程。因此，廣義的基因工程概念更傾向于工程學的范疇。

第5頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第6頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四廣義的基因工程是一個高度統(tǒng)一的整體。上游DNA重組的設計必須以簡化下游操作工藝和裝備為指導思想。而下游過程則是上游基因重組藍圖的體現(xiàn)與保證。這是基因工程產(chǎn)業(yè)化的基本原則。第7頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四狹義的基因工程

重組DNA技術

廣義的基因工程

重組DNA技術細胞工程染色體工程細胞器工程第8頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四二、基因工程的基本過程

基因工程:兩大部分組成

基因工程的整個過程由工程菌(細胞)的設計構建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成

工程菌(細胞)的設計構建:實驗室里進行，其單元操作過程如下:(1)從供體細胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA(包括外源基因或目的基因)和載體分子切開(簡稱“切”)；第9頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

(2)用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段接到載體分子上形成DNA重組分子(簡稱“接”)；

(3)借助于細胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導入受體細胞中(簡稱“轉(zhuǎn)”)；(4)短時間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細胞、以擴增DNA重組分子或使其整合到受體細胞的基因組中(簡稱“增”)；(5)篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達的基因工程菌或細胞(簡稱“檢”)；基因工程的上游操作過程；可簡化為：切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。

第10頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三．基因工程的基本原理

基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達為目的．其基本原理可從以下四個方面考慮。（1)利用載體DNA在受體細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過載體分子的擴增提高外源基因在受體細胞中的劑量．借此提高其宏觀表達水平。這里涉及到DNA分子高拷貝復制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學原理。第11頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

(2)篩選、修飾和重組啟動子、增強子、操作子、終止子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并將這些元件與外源基因精細拼接．通過強化外源基因的轉(zhuǎn)錄提高其表達水平。

(3)選擇、修飾和重組核糖體結合位點及密碼子等mRNA的翻譯調(diào)控元件。強化受體細胞中蛋白質(zhì)的生物合成過程。

上述(2)和(3)兩點均涉及到基因表達調(diào)控的分子生物學原理。第12頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四(4)基因工程菌(細胞)是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應器，在強化并維持其最佳生產(chǎn)效能的基礎上，從工程菌(細胞)大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應器的增殖速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達產(chǎn)物產(chǎn)量的主要環(huán)節(jié)，這里涉及的是生物化學工程的基本理論體系。因此．分子遺傳學、分子生物學以及生物化學是基因工程原理的三大基石。第13頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四.四、生物工程等概念生物工程：直接或間接利用生物體的機能生產(chǎn)物質(zhì)的技術。包括發(fā)酵技術、基因重組、細胞融合、細胞大量培養(yǎng)、生物反應器等技術。生物技術：是在細胞水平上，特別是在分子水平上對生物體遺傳性實現(xiàn)巨大的接近定向改造的一套內(nèi)容繁多和復雜的技術。包括基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等。第14頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四現(xiàn)代科技革命高新技術生物技術基因工程基因克隆第15頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第二節(jié)

基因工程的發(fā)展歷史基因工程的發(fā)展歷史概括為三個階段

基因工程的誕生

基因工程的成熟基因工程的騰飛第16頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四一、基因工程的誕生

基因工程是一項新興的工程技術，它的誕生需要理論和技術上的支持理論上的三大發(fā)現(xiàn)技術上的三大發(fā)明第17頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先導）DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理遺傳信息的傳遞方式（中心法則）1.理論上的三大發(fā)現(xiàn)第18頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

證明了生物的遺傳物質(zhì)是DNA（基因工程的先導）：1944年首先用體外的轉(zhuǎn)化實驗證明基因的化學本質(zhì)就是DNA分子的是加拿大生物化學家艾弗里O.T.Avery（1877-1955）。他和他的合作者C．M．MacLeod及M．McCarty在紐約進行細菌轉(zhuǎn)化的研究。

1)遺傳物質(zhì)是DNA第19頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

體外的轉(zhuǎn)化實驗證明基因就是DNA分子第20頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四2).DNA的雙螺旋結構和半保留復制機理

DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)Watson（沃森）andCrick（克里克）（1953）

美國遺傳學家Watson(J.Watson)和英國生物學家克里克(F.Crick)

1953年4月25日DNA的雙螺旋結構假說（不到1000字的短文）《核酸的分子結構——脫氧核糖核酸的一個結構模型》在（自然）雜志上發(fā)表。1個月后在（自然）雜志上又發(fā)表了遺傳物質(zhì)的復制機理。1962年與M.H.F.Wilkins共獲諾貝爾生理學獎。DNA半保留復制機理的證明－Meselson-Stahl實驗(1958)DNA復制模式的破解M.Meselson(MatthewMeselson,西爾遜)andF.W.Stahl(FranklinStahl,斯塔爾)(1958)1958年來西爾遜（Meselson）和斯塔爾（Stahl）首次在分子水平上成功地證明了DNA的半保守復制（semiconservativereplication）利用氮標記技術在大腸桿菌中首次證實了DNA的半保留復制(15N)

第21頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四DNA半保留復制圖第22頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四3）遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958)中心法則的確立F.Crick(1958）1958年克里克確立的中心法則(1971年修改),最早提出遺傳密碼這一名詞的是量子力學奠基人之一，奧地利物理學家施勒丁格(E．Schrodinger，1944)。第一個提出遺傳密碼具體設想的是美國物理學家G.Gamov，他通過推算提出了三聯(lián)體密碼子的概念，并且進一步推論一種氨基酸可能不止有一個密碼子。第一個用實驗破譯密碼子的是馬太(Matthaei)和尼倫伯格(Nirenberg)，1966M.NirenbergandH.Khorana（1968年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者）建立了完整的遺傳密碼表第23頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四DNA技術分子體外切割與連接技術限制性內(nèi)切酶(1970)和DNA連接酶(1967)發(fā)現(xiàn)，標志著DNA重組時代的開始基因工程載體技術

1970載體（vector）的使用成功1970年，逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)使真核基因的制備成為可能。2技術上的三大發(fā)明第24頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四DNA技術分子體外切割與連接技術

·

—限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶HindⅡ1970年，美國生化學家Simith和Wilcox從流感嗜血桿菌中分離提純了限制性核酸內(nèi)切酶

HindⅡ（1978年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者)EcoR1限制性核酸內(nèi)切酶(1972年Bover實驗室發(fā)現(xiàn)）G↙AATTCDNA連接酶的發(fā)現(xiàn)：1967年世界上5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。1970年，在美國Khorana實驗室發(fā)現(xiàn)了一種高效連接活性的DNA連接酶—T4DNA連接酶

第25頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

1970美國DulleccoTemin和Baltimore（1975年諾貝爾生理醫(yī)學獎獲得者）在腫瘤病毒中存在反轉(zhuǎn)錄酶打破了中心法則，使真核基因的制備成為可能。

DNA分子序列分析及相關技術的發(fā)展也推動了基因工程的發(fā)展DNA分子的核苷酸序列分析技術，瓊脂糖凝膠電泳和Southern雜交技術等技術的展?；蚬こ梯d體技術1970載體（vector）的使用成功.1970年λ噬菌體導入大腸桿菌細胞內(nèi)（轉(zhuǎn)化）1970年，逆轉(zhuǎn)錄的發(fā)現(xiàn).第26頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四

1973年，美國斯坦福大學Boyer和Cohen等獲得了抗四環(huán)素和抗新霉素（卡那霉素）的重組菌落，標志著基因工程的誕生。1973年建立的基因工程的基本模式為標志的。他們將大腸桿菌體內(nèi)的兩個不同的質(zhì)粒提取出來，拼接成一個雜合的質(zhì)粒。當雜合質(zhì)粒被導入大腸桿菌后，它能在大腸桿菌內(nèi)復制并表達雙親質(zhì)粒的遺傳信息。這是基因工程的第一個成功的克隆轉(zhuǎn)化實驗。

Tetracycline

pSC101EcoRIDNALigaseKanamycin

R6-5Kanr

andTetr基因工程的誕生標志第27頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四基因工程的成熟

1977年日本的Itakura及其同事首次在大腸桿菌中克隆并表達了人的生長激素釋放抑制素基因。幾個月后．美國的Ullvich克隆并表達了人的胰島素基因。1978年，美國Genentech公司開發(fā)出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進生產(chǎn)工藝，從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

第28頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四表1-1主要基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間產(chǎn)品時間國家用途上市時間國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗（HBsAgV）1983美國乙肝1986歐洲人白細胞介素1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國第29頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、基因工程的騰飛：1.1982年，美國人，大鼠生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠；

2.1983年，美國人，Ti質(zhì)粒導入植物細胞（細菌Neor基因）

3.1990年，美國人，腺苷脫氨酶（ADA）基因治療，重度聯(lián)合免疫缺陷癥（SDID）

4.1990年，美國倡導，人類基因組計劃，15年時間30億USD；2000年6月26日各國科學家向全世界宣布“人類基因組計劃”工作草圖繪制成功，“基因”和“基因組研究”更是成為人們談論的焦點問題。2003人類基因組側序完成。5.1997年，英國，克隆多利綿羊第30頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第31頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四三、基因工程的騰飛：第32頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第33頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四第34頁，共39頁，2023年，2月20日，星期四四.基因工程的意義

基因工程可以繞過遠緣有性雜交的困難，使基因在微生物、植物、動物之間交流，迅速并定向的獲得人類需要的新的生物類型概括地講，其意義體現(xiàn)在以下三個方面大規(guī)模生產(chǎn)生物分子；

設計構建新