培養(yǎng)基及其配制

培養(yǎng)基及其配制第1頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四培養(yǎng)基(culturemedium)

：---是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。(土壤+自養(yǎng)條件）

---不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同，只有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。第2頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四一、培養(yǎng)基的種類最早的培養(yǎng)基:是Sacks(1680)和Knop(1681)，根據(jù)植物從土中主要是吸收無機(jī)鹽營養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無機(jī)鹽組成的Sacks和Knop溶液.第3頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下：(1)MS培養(yǎng)基1962年，Murashige和Skoog，培養(yǎng)煙草細(xì)胞。特點(diǎn)：無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液；硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高；應(yīng)用廣泛—基本培養(yǎng)基。(2)B5培養(yǎng)基1968年，Gamborg等，培養(yǎng)大豆根細(xì)胞。特點(diǎn)：含有較低的銨，對有些植物的生長有抑制作用；適宜于雙子葉植物特別是木本植物。(3)White培養(yǎng)基1943年，White，培養(yǎng)番茄根尖。特點(diǎn)：無機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。（4）N6培養(yǎng)基1974年，朱至清等，水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)。特點(diǎn)：成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花藥培養(yǎng)和其他組織培養(yǎng)。(5)KM—8P培養(yǎng)基1974年，原生質(zhì)體培養(yǎng)。特點(diǎn)：有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素，廣泛用于原生質(zhì)融合的培養(yǎng)。第4頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四二、培養(yǎng)基的成分

水、無機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、植物激素、培養(yǎng)體的支持材料、抗生素、活性炭等。第5頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（一）水

是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。它是生命活動過程中不可缺少的物質(zhì)。配制培養(yǎng)基母液時(shí)要用蒸餾水，以保持母液及培養(yǎng)基成分的精確性，防止貯藏過程發(fā)霉變質(zhì)。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水，以防成分的變化引起不良效果。第6頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（二）無機(jī)元素(inorganicelement)

大量元素：指濃度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N

是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、生物膜等的組成成分，是生命不可缺少的物質(zhì)。供應(yīng)形式：NO3—N、NH4—N。NH4—N對植物生長較為有利。供應(yīng)物質(zhì)：KNO3、NH4NO3、

K2SO4、氨基酸等。(2)P

是磷脂的主要成分。參與生物膜、核酸、ATP、ADP等的組成。供應(yīng)形式：磷酸二氫根、磷酸氫根供應(yīng)物質(zhì)：KH2P04或NaH2P04等。在植物組織培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對N的吸收，增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。第7頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四(3)K

作用：對碳水化合物合成、轉(zhuǎn)移、以及氮素代謝等有密切關(guān)系。一般為1—3mg／L為好。供應(yīng)物質(zhì)：KCI、KN03等鹽類提供。(4)Mg、S和CaMg-是葉綠素的組成成分，又是激酶的活化劑；S-是含S氨基酸和蛋白質(zhì)的組成成分。Ca-是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ca對細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯著作用。第8頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四微量元素指小于0.5mmol／L的元素，F(xiàn)e，B，Mn，Zn、Cu，Mo，Co等。鐵-是一些氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、過氧化氫酶等的組成成分；是葉綠素形成的必要條件。對胚的形成、芽的分化和幼苗轉(zhuǎn)綠有促進(jìn)作用。供應(yīng)物：鰲合鐵（FeSO4·7H20+Na2—EDTA）在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Fe2（SO4）3，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等：也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會導(dǎo)致生長、發(fā)育異?，F(xiàn)象。第9頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（三）有機(jī)化合物(organiccompound)

培養(yǎng)基中若只含有大量元素與微量元素，常稱為基本培養(yǎng)基（basicmedium)。為不同的培養(yǎng)目的往往要加入一些有機(jī)物以利于快速生長。常加入的有機(jī)成分主要有以下幾類：第10頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四碳水化合物

最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。

——蔗糖使用濃度在2%—5%，常用3%，即配制一升培養(yǎng)基稱取30g蔗糖?！邏簻缇鷷r(shí)，一部分糖會發(fā)生分解，制定配方時(shí)要給予考慮。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，可用食用的綿白糖代替。第11頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四維生素(vitamin)

以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。VBl(鹽酸硫胺素)：對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用。VB6(鹽酸吡哆醇)：能促進(jìn)根的生長。Vpp(煙酸)：與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc（抗壞血酸）：有防止組織變褐的作用。(酚類物質(zhì)-醌)

一般用量：0．1—1．0mg／L。有時(shí)用量較高。有時(shí)還使用生物素、葉酸、VB12等。第12頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四肌醇(myo—inosltol)又叫環(huán)己六醇作用：能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用。對細(xì)胞壁的形成也有作用。使用濃度：一般為lOOmg／L，第13頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四氨基酸(alminoacide)

是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。常用的氨基酸：甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。水解乳蛋白或水解酪蛋白：它們是牛乳用酶法等加工的水解產(chǎn)物，是含有約20種氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之間。由于它們營養(yǎng)豐富，極易引起污染。如在培養(yǎng)中無特別需要，以不用為宜。第14頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（四）天然復(fù)合物其成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物。它對細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用，但對器官的分化作用不明顯。它的成分大多不清楚，所以一般應(yīng)盡量避免使用。第15頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四

1)椰乳是椰子的液體胚乳。它是使用最多、效果最大的一種天然復(fù)合物。一般使用濃度在10%—20%，與其果實(shí)成熟度及產(chǎn)地關(guān)系也很大。它在愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)中有促進(jìn)作用。在馬鈴薯莖尖分生組織和草莓微莖尖培養(yǎng)中起明顯的促進(jìn)作用，但莖尖組織的大小若超過1nun時(shí)，椰乳就不發(fā)生作用。2)香蕉用量為150-200ml／L。用黃熟的小香蕉，加入培養(yǎng)基后變?yōu)樽仙?。對pH值的緩沖作用大。主要在蘭花的組織培養(yǎng)中應(yīng)用，對發(fā)育有促進(jìn)作用。3)馬鈴薯(potato)

去掉皮和芽后，加水煮30min，再經(jīng)過過濾，取其濾液使用。用量為150—200g／L。對pH值緩沖作用也大。添加后可得到健壯的植株。4)水解酪蛋白為蛋白質(zhì)的水解物，主要成分為氨基酸，使用濃度為100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用時(shí)要注意。5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(0.01%～0.5%)、蘋果和番茄的果汁、黃瓜的果實(shí)、未熟玉米的胚乳等。遇熱較穩(wěn)定，大多在培養(yǎng)困難時(shí)使用，有時(shí)有效。

第16頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（五）植物生長調(diào)節(jié)物(hormone)

▲植物激素是植物新陳代謝中產(chǎn)生的天然化合物，它能以極微小的量影響到植物的細(xì)胞分化、分裂、發(fā)育，影響到植物的形態(tài)建成、開花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理生化活動。▲植物激素的種類：促進(jìn)生長：生長素、細(xì)胞分裂素、赤霉素抑制生長：脫落酸、乙烯▲在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。第17頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四1.生長素類(auxin)

主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成，誘導(dǎo)根的分化和促進(jìn)細(xì)胞分裂、伸長生長。

☆I(lǐng)AA(indoaceticacid吲哚乙酸)是天然存在的生長素，亦可人工合成，其活力較低，是生長素中活力最弱的激素，對器官形成的副作用小、，高溫高壓易被破壞，也易被細(xì)胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解?！頝AA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)在組織培養(yǎng)中的起動能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高溫高壓，不易被分解破壞，所以應(yīng)用較普遍。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長。☆I(lǐng)BA(indolebutyriacid吲哚丁酸)是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)?！?，4—D(2，4—二氯苯氧乙酸)起動能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成，影響器官的發(fā)育。適宜的用量范圍較狹窄，過量常有毒效應(yīng)。第18頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四2.細(xì)胞分裂素類

(cytokinin)

這類激素是腺嘌吟的衍生物，包括6—BA(6—芐基腺嘌呤)、Kt(kinetin激動素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最強(qiáng)，但非常昂貴，常用的是6—BA。作用：①誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長。②促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。③抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。第19頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四

3.GA(gibberellicacid赤霉素)

作用：▲促進(jìn)幼苗莖的伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株；▲赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響。（當(dāng)生長素／赤霉素比值高時(shí)有利于木質(zhì)部分化，比值低時(shí)有利于韌皮部分化）▲赤霉素還用于打破休眠，促進(jìn)種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)。

第20頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四激素配比模式生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向:高有利于根的形成和愈傷組織的形成生長素/細(xì)胞分裂素適中有利于根芽的分化、愈傷組織低有利于芽的形成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg／L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異。一般生長素濃度的使用為0.05-5mg／L，細(xì)胞分裂素0.05—10mg／L。第21頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurface

Veryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet第22頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四NoBABAreducedto0.1mg.l-1

NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1

Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant第23頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.

MSsaltsreducedto0.47g.l-1

SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1

Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.第24頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（六）培養(yǎng)材料的支持物瓊脂(agar)：是最好的固化劑。是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水(90℃)中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的用量:在6—10g／L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會變得很硬，營養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。一般瓊脂以顏色淺、透明度好、潔凈的為上品。瓊脂的凝固能力:與高壓滅菌時(shí)的溫度、時(shí)間、pH值等因素有關(guān)，長時(shí)間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時(shí)間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。

第25頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四固體培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，易于解決通氣問題，便于經(jīng)常觀察研究

固體培養(yǎng)基的缺點(diǎn)：培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。其他：有玻璃纖維、濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有害物質(zhì)對培養(yǎng)材料沒有影響或影響較小。第26頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（七）抗生物質(zhì)(antibiotic)抗生物質(zhì)：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等，用量在5—20mg/L之間。----對于剛感染的組織材料，可向培養(yǎng)基中注入5%—10%的抗菌素?？股馗饔衅湟志V，要加以選擇試用，也可兩種抗生素混用。

注意:----抗生素對植物組織的生長也有抑制作用;----某些植物適宜用青霉素，而另一些植物卻不大適應(yīng);----在工作中不能以為有了抗菌素，而放松滅菌措施----在停止抗生素使用后，往往污染率顯著上升，這可能是原來受抑制的菌類又滋生起來造成。第27頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四（八）活性炭(activecarbon)活性炭——木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉沫結(jié)構(gòu)，它結(jié)構(gòu)疏松，孔隙大，吸水力強(qiáng)，有很強(qiáng)的吸附作用。使用濃度：0.5—l0g／L。第28頁，共31頁，2023年，2月20日，星期四活性炭的應(yīng)用1、具抑褐作用：可以吸附外植體產(chǎn)生的致死性褐化物，其效力優(yōu)于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖階段，活性炭可明顯促進(jìn)新梢的形成和伸長，一般使用濃度為0.1%—0.2%，不能超過0.2%。2、活性炭對生根培養(yǎng)有明顯的促進(jìn)作用：其機(jī)理一般認(rèn)為與活性炭減弱光照有關(guān)，可能是由于根頂端產(chǎn)生促進(jìn)根生長的IAA，但I(xiàn)AA易受可見光的光氧化而破壞，因此活性炭的主要作用就在于通過減弱光照保護(hù)了IAA，從而間接促進(jìn)了根的生長，由