小鼠骨髓染色體制備與觀察

實(shí)驗(yàn)三、

小鼠骨髓染色體標(biāo)本的

制備及觀察趙興華

醫(yī)用生物學(xué)教研室

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪秸莆眨ㄐ∈螅┕撬杓?xì)胞染色體標(biāo)本的制備原理和方法鞏固顯微鏡的操作技術(shù)了解小鼠的染色體形態(tài)特征二、實(shí)驗(yàn)原理染色體是組成細(xì)胞核的基本物質(zhì)，是基因的載體。染色體異常也稱染色體發(fā)育不全。目前已確認(rèn)染色體病綜合征100余種，智力低下和生長(zhǎng)發(fā)育遲滯是染色體病的共同特征。21三體綜合征；18三體綜合征、貓叫綜合征18三體綜合征二、實(shí)驗(yàn)原理染色體標(biāo)本的觀察廣泛應(yīng)用于一些疾病的臨床診斷中。例如白血病、惡性血液病等的診斷。染色體是染色質(zhì)在細(xì)胞分裂期的存在形式。細(xì)胞分裂的中期，染色體在赤道板上排列清晰，是染色體觀察的最佳時(shí)期。

骨髓細(xì)胞數(shù)量多且分裂旺盛，可直接進(jìn)行染色體標(biāo)本的制備。取材方便，操作簡(jiǎn)單和無需體外培養(yǎng)和無菌操作，是研究小型哺乳動(dòng)物等染色體的常用方法。人骨髓染色體抽取

怎樣才能制備一個(gè)好的染色體標(biāo)本？獲得大量處于有絲分裂中期的細(xì)胞。使細(xì)胞膜破裂，且染色體能夠完整并較分散的釋放出來。秋水仙素處理：秋水仙素溶液可抑制紡錘體的形成，使正在分裂的骨髓細(xì)胞停止在細(xì)胞分裂中期，積累大量中期分裂相細(xì)胞。低滲作用:使細(xì)胞充分膨脹，減少染色體間的相互纏繞和重疊。預(yù)固定：終止低滲作用，使細(xì)胞離心時(shí)不易破裂，固定維持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。高距離滴片：使細(xì)胞膜易于破裂，獲得中期染色體標(biāo)本，在顯微鏡下觀察染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量。三、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1、器材

蠟盤、手術(shù)剪、小鑷子、平皿、注射器、10ml離心管、吸管、量筒、預(yù)冷載玻片、試管架、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、顯微鏡、香波油、乙醚酒精、擦鏡紙2、試劑

100ug秋水仙素液、0.075mol/LKCl低滲液、Giemsa染液，固定液（甲醇：乙酸=3:1）1.秋水仙素處理：選擇體重20g左右的小白鼠，按2~4ug/g(小鼠)秋水仙素，于處死前4h，對(duì)其進(jìn)行腹腔注射100ug/mL秋水仙素液。四、實(shí)驗(yàn)步驟

注意：剪去少量骨質(zhì)，避免骨髓細(xì)胞丟失；擦凈血跡和肌肉細(xì)胞以免影響觀察；用0.075mol/LKCl收集足量細(xì)胞，反復(fù)沖洗直到股骨發(fā)白。2.取材：頸椎脫臼法處死

取兩后肢股骨紗布擦凈肌肉剪去股骨兩頭，暴露骨髓腔低滲液(5ml)沖洗至離心管內(nèi)收集骨髓細(xì)胞頸椎脫臼法處死小鼠3.低滲：用吸管吹打骨髓細(xì)胞使其分散，加入預(yù)溫37℃的低滲液至8ml,將離心管至37℃水浴鍋中，保溫至少30min后取出，使細(xì)胞充分吸水膨脹。

低滲不足，則細(xì)胞膨脹不夠，滴片時(shí)細(xì)胞不易破裂，染色體也不易分散開。

低滲過度，則細(xì)胞提前破裂，染色體觀察不全?？諝獯荡蚍ǎ河梦芟鹉z頭內(nèi)的空氣混勻液體。4.預(yù)固定：加1ml新配制固定液混勻1500r/min，5min棄上清液。

固定液（甲醇：冰乙酸=3:1）需現(xiàn)配；離心需要配平。作用：終止低滲；維持細(xì)胞的膨脹狀態(tài)；防止離心破裂5.固定、制細(xì)胞懸液：加固定液5ml吹打混勻

固定15min離心1500r/min，5min

棄上清，加固定液0.2~0.4ml

吹打成細(xì)胞懸液，準(zhǔn)備制片使用。制備細(xì)胞懸液時(shí)，根據(jù)具體情況加固定液，以懸液呈現(xiàn)乳白色為宜。

6.滴片：冰片傾斜30°,

細(xì)胞懸液距離玻片15-30cm高，在不重疊位置滴1～2滴，用口順著傾斜面吹散細(xì)胞，迅速過火焰3-5次進(jìn)行干燥。

注意：a.溫度、高度、傾斜度b.火焰干燥的目的：使固定液迅速揮發(fā)，產(chǎn)生四周張力加速細(xì)胞破裂，使染色體更好地粘連在載玻片上；不可使載玻片燙手。7.染色：在玻片上滴幾滴Giemsa染液并鋪勻，染色8～10min，倒去染液，用自來水緩緩沖洗干凈、晾干。（染色盤中進(jìn)行）注意：采用平鋪的方法8.小鼠染色體觀察：低倍鏡、高倍鏡下尋找染色體分散的中期分裂相，移至視野中央進(jìn)行觀察。

小鼠骨髓染色體10×10小鼠骨髓染色體10×40數(shù)目觀察：小鼠2倍體細(xì)胞染色體，數(shù)目2n=40條。其中19對(duì)為常染色體，一對(duì)為性染色體，染色體的核型分為4組。雄性XY,雌性XX,Y染色體最小。形態(tài)特征觀察：端著絲粒染色體“U”，“V”。五、注意事項(xiàng)1．掌握好秋水仙素的濃度和處理時(shí)間；2．離心前需要配平；3.小鼠骨髓要沖洗干凈，以收集足夠的骨髓細(xì)胞；3．低滲處理是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，注意低滲時(shí)間；4．固定液要現(xiàn)配現(xiàn)用，固定要充分；5．載玻片要潔凈并預(yù)冷，滴片要有一定的高度和傾斜度；6.細(xì)胞懸液不能太稀，要