玉米穗軸對穗腐病抗性鑒定體系及優(yōu)異抗源研究

玉米穗軸對穗腐病抗性鑒定體系與優(yōu)異抗源的研究1王昭1，穆聰1，李云夢1，高景陽1，宋云霞1，董朝沛1，馬培培1，赫可偉1，許靜1，董華芳1，孫小東

1，韓亞楠1，周子健1，陳甲法2，吳建宇1（1.河南農業(yè)大學農學院，鄭州450002；2.河南農業(yè)大學生命科學學院，鄭州450002）摘要:穗軸作為擬輪枝鐮孢菌侵染果穗引發(fā)玉米穗腐病的重要途徑之一，能夠影響病原菌的侵染和擴散。為了深入開展玉米穗軸對擬輪枝鐮孢菌抗性的研究以及了解玉米穗腐病籽粒與穗軸抗性的差異，本研究進行了抗性鑒定體系的優(yōu)化，并進一步利用164份國內外玉米骨干自交系進行了兩年兩點的接種鑒定篩選優(yōu)異抗源。通過對發(fā)病邊長、發(fā)病芯長、發(fā)病面積、發(fā)病相對面積等4個抗性指標進行研究，發(fā)現其中發(fā)病邊長能較大程度地區(qū)分不同自交系間的抗感差異且又在材料內具有較好的重演性，因此把發(fā)病邊長確定為玉米穗腐病穗軸抗性鑒定指標，進而對參試自交系進行了抗性評價，鑒定出CML27、BT-1、CML274等58份穗軸高抗自交系，同時篩選出BT-1、CML173、CML193等8份籽粒與穗軸均抗穗腐病的優(yōu)異抗源，為玉米穗腐病抗性遺傳研究以及抗病育種工作奠定了基礎。關鍵詞：玉米穗腐?。凰胼S抗性；鑒定指標；優(yōu)異抗源StudyonCobInoculationSystemandEliteResistantInbredLinesScreenedtoMaizeEarRotWANGZhao1，MUCong1，LIYun-meng1，GAOJing-yang1，SONGYun-xia1，DONGChao-pei1，MAPei-pei1，HEKe-wei1，XUJing1，DONGHua-fang1，SUNXiao-dong1，HANYa-nan1，ZHOUZi-jian1，CHENJia-fa2，WUJian-yu1（1.CollegeofAgronomy,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002;2.CollegeofLifeScience,HenanAgricultureUniversity,Zhengzhou450002,China）Abstract:Asanimportantpathway,cobcanaffecttheinfectionandspreadofFusariumverticillioideinmaizeear.InordertostudythecobresistancetoFusariumverticillioideandtounderstandthedifferencebetweenkernelresistanceandcobresistanceinmaize,theidentificationsystemofcobresistancewasoptimized.Inaddition,164inbredlinesweresurveyedtoestablishthecobresistanceidentificationsystemandtoselectexcellentresistanceinbredlinesintwoyearsandtwolocations.By基金項目：國家自然科學基金項目（31671281）、國家自然科學基金項目（31761143009）作者簡介：王昭（1994-）,河南鄧州人，碩士，研究方向為作物遺傳育種。E-mail：475356602@吳建宇為本文通訊作者。E-mail：wujianyu40@126.comanalyzedofthefourindexes(surroundinginfectedlength,internalinfectedlength,infectedareaandrelativeinfectedarea),thesurroundinginfectedlengthwasidentifiedasoptimal,whichhasbetterrepeatabilityinsameinbredlineandcaneasierdistinguishtheresistancebetweendifferentinbredlines.Fifty-eightinbredlineswithhighresistanceofcobwereidentified,suchasCML27,BT-1,CML274,etc.Atthesametime,eliteinbredlinesBT-1,CML173,CML193andothereightinbredlineswithhighresistancetoearrotinbothkernelandcobwerescreenedout.Theseresultslaidafoundationfordiseaseresistancebreedingandresistanceinheritanceresearch.Keywords:MaizeEarRot;ResistanceofCob;Identificationindex;EliteInbredLines玉米穗腐病是世界上普遍發(fā)生、危害嚴重、防治困難的一種真菌性病害，其中擬輪枝鐮孢菌是優(yōu)勢病原菌之一［1,2,3］。病原菌從玉米苗期到成熟期以及收獲后籽粒脫粒期均可侵染，主要通過花絲和籽粒的傷口進行侵染，還可以通過輸導組織從根或莖傳至穗軸，進而侵染籽粒［4-6］。隨著我國黃淮海地區(qū)小麥-玉米輪作以及秸稈還田技術的普及與推廣，致病鐮孢菌循環(huán)侵染并在土壤中大量積累，導致穗腐病的發(fā)生逐年加重［4］。穗軸既是病原菌從植株內部自根向上侵染玉米籽粒的通道，也是病原菌從外部經花絲侵染果穗后加快擴散的重要途徑。此外，玉米害蟲蛀蝕并在穗軸內寄生，也會加速病原菌的侵染和擴散［7］。Oldenburg等網通過對毒素分布的研究，發(fā)現毒素含量自穗軸頂端到基部呈現由高到低的趨勢，并且穗軸內毒素的積累相對于籽粒更高，表明鐮孢菌主要由穗軸頂端向基部傳播，籽粒隨后被侵染。Morales等［9］認為穗軸的形態(tài)特征與擬輪枝鐮孢菌危害程度和伏馬毒素的污染水平相關。同時，玉米穗腐病的發(fā)生存在組織特異性，表現出籽粒與穗軸發(fā)病不同步的現象［10］。穗軸感病的果穗在擬輪枝鐮孢菌侵染后期會形成爆發(fā)趨勢，加重了穗腐病的發(fā)生，造成了穗軸松軟腐爛，嚴重影響玉米機械化收獲。在注重玉米籽?？剐缘耐瑫r，加強穗軸抗性的選擇，能夠有效抑制病原菌的侵染和擴散。本研究參考前期使用的針刺果穗法并完善穗軸抗性鑒定體系，利用多個指標、多個環(huán)境對供試自交系接種并進行抗性鑒定，篩選優(yōu)異抗源，進而進行抗性評價。從穗軸抗性的角度加深對玉米穗腐病的認識，為深入開展玉米抗穗腐病遺傳機制的研究以及抗病育種工作奠定基礎。1材料與方法供試材料供試材料為164份優(yōu)良玉米自交系，包括Reid、Lancaster、塘四平頭、旅大紅骨、P群和CIMMYT的熱帶、亞熱帶自交系。試驗采用病原菌為擬輪枝鐮孢菌（Fusariumverticillioide）。試驗設計2014年6月與2015年6月，分別在鄭州河南農業(yè)大學科教園區(qū)（北緯N34°51‘56.34〃東經EU3°35′5.70〃）、溫縣平安種業(yè)基地（北緯N34°56‘59.26〃東經E112°59‘26.35〃）進行田間試驗，采用隨機區(qū)組試驗設計，每個地點兩次重復，每個重復種植一行，每行種植20穴，每穴2粒。行長為4m，行距0.67m,株距0.21m，3~5葉期進行間苗、定苗。進行常規(guī)的田間管理，并在喇叭口期，采用呋喃丹顆粒灌芯的方法進行玉米螟防治；在生育后期，噴施2.5%的高效氯氟氰菊酯2000-2500倍液，對玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲等玉米地上害蟲進行防治。接種體系接種時期根據供試材料的吐絲期，集中分3~4批進行人工輔助授粉，授粉15天后接種。此時雌穗的形態(tài)特征為花絲呈暗棕色或褐色，而籽粒內部充滿漿汁。接種方法參考針刺果穗法［11-13］，孢子懸浮液濃度為5x106個/mL，接種量為1mL。接種時菌液加入吐溫-80，濃度約為2］iL/mL。用自制連續(xù)注射器進行接種，接種點選在果穗中部向下1~2厘米處，接種至穗軸上，用紙膠帶封住接種口，防止菌液外流以及玉米螟危害。表型調查與抗性鑒定接種30天后收獲果穗并曬干，將玉米穗軸縱向鋸開后觀察。病原菌侵染的穗軸髓部呈棕褐色，用標尺進行測量，病原真菌侵染穗軸的橫向長度等于軸粗。將病原菌沿籽粒基部侵染的縱向長度定義為發(fā)病邊長，將病原菌在穗軸髓部侵染的縱向長度定義為發(fā)病芯長，將發(fā)病邊長和軸粗的乘積定義為發(fā)病面積，將發(fā)病面積和穗軸橫切面面積的比值定義為相對發(fā)病面積。玉米穗腐病穗軸的抗性評價利用參考品種法［14］，將參試自交系分為高抗（HR）、抗（R）、中抗（MR）、感（S）、高感（HS）等5個等級（表1）。a為20個極抗材料的平均值，b為20個極感材料的平均值，d=（b-a）/8，PV為表型值。表1玉米穗軸抗性評價標準Table1Evaluationofcobresistanceinmaize

抗性評價Evaluationofcobresistance表型值phenotypicvalue高抗(HR)PV<a+d抗(R)a+d<PV<a+3d中抗(MR)a+3d<PV<a+5d感(S)a+5d<PV<a+7d高感(HS)PV>a+7d1.6數據分析使用MicrosoftOfficeExcel2016進行數據統計與方差分析和變異系數的計算及圖表的繪制。使用IBMSPSSStatistics21軟件進行相關性分析。2.結果與分析玉米穗腐病穗軸的抗性指標研究從164個供試材料中隨機選擇30份自交系，進行4個抗性指標(發(fā)病邊長、發(fā)病芯長、發(fā)病面積、相對發(fā)病面積)的平均數與變異系數比較分析，發(fā)現發(fā)病邊長平均數的范圍為0.38~10.90；發(fā)病芯長平均數的范圍為0.03~9.55；發(fā)病面積平均數的范圍為0.48~32.62；相對發(fā)病面積平均數的范圍為0.03~0.88。材料內發(fā)病邊長的變異系數普遍較小，其次是相對發(fā)病面積、發(fā)病面積與發(fā)病芯長(表2)。分析表明，發(fā)病邊長在4個抗性指標中重復性最好，實驗誤差較小。表24個抗性指標的平均數及變異系數Table2Meanandcoefficientofvariationoffourresistanceindexes材料Material發(fā)病邊長Surroundinginfectedlength發(fā)病芯長Internalinfectedlength發(fā)病面積Infectedarea相對發(fā)病面積Relativeareainfected平均數Mean變異系數CV平均數Mean變異系數CV平均數Mean變異系數CV平均數Mean變異系數CVCML1890.390.360.071.730.480.40.030.4CML2740.411.060.112.451.241.360.031.05CML1530.450.750.181.451.370.840.040.75CML4950.490.230.270.871.650.240.040.23(BT-N6)RIL2250.541.28CML2230.531.220.281.480.681.410.031.22CML850.530.771.080.040.78CML4920.540.730.141.781.40.940.040.7CML4730.570.440.660.060.45CML1810.570.770.032.831.490.810.040.83CML1730.60.730.191.581.690.940.040.73

CML4210.60.910.271.671.841.010.040.92CML3040.620.720.172.080.880.870.040.76CML1930.620.510.251.852.040.690.040.49BT-10.381.450.081.860.781.30.021.44CML1392.150.731.710.953.80.980.140.7512H563-1-TSPT212.191.530.492.514.861.580.21.46CML1452.290.582.290.582.940.640.230.62CML2582.30.381.850.635.820.830.170.3912H563-1-TSPT132.320.641.191.366.260.730.240.64CML2822.70.570.871.154.510.620.320.67CML1542.720.581.480.834.590.890.160.87（BT-N6）RIL1072.811.461.711.723.781.540.181.46（BT-N6）RIL1622.870.782.010.817.7812H577-1-Reid63.470.62.860.8913.740.790.30.6112H664-1-Reid103.530.972.311.4614.211.480.240.8912H690-1-PB16.720.816.50.8926.971.040.450.76N66.930.695.850.8718.841.390.680.65（BT-N6）RIL647.480.647.220.7219.420.680.650.62西5050.4532.620.410.880.1對164個供試材料的4個指標的均值進行分析（表3），發(fā)現發(fā)病芯長和發(fā)病邊長的變異系數較大，分別為1.93和1.59，而發(fā)病面積和發(fā)病相對面積的變異系數較小，分別為1.02和0.95。說明發(fā)病芯長與發(fā)病邊長能夠較大程度地區(qū)分開不同材料間的抗性差異。表3164個供試自交系4個抗性指標均值及變異系數Table3Meanandcoefficientofvariationoffourresistantindexesbetween164testmaterials指標平均值標準差變異系數（％）IndexMeanStandarddeviationCV發(fā)病邊長1.492.371.59發(fā)病芯長1.342.581.93發(fā)病面積4.254.341.02發(fā)病相對面積5 進而對4個抗性指標進行相關性分析（表4），發(fā)現4個指標間均極顯著相關。結合各指標變異系數分析結果，發(fā)病邊長既能較大程度地區(qū)分不同自交系間的抗感差異，又能降低材料內的誤差，重復性好，因此把發(fā)病邊長確定為玉米穗腐病穗軸抗性指標，以此為指標開展后續(xù)的穗軸抗性鑒定以及抗性遺傳研究。表44個抗性指標的相關性分析結果Table4Correlationanalysisoffourindicators指標Index發(fā)病邊長Surroundinginfectedlength發(fā)病芯長Internalinfectedlength發(fā)病面積Infectedarea發(fā)病相對面積Relativeareainfected發(fā)病邊長1發(fā)病芯長0.938**1發(fā)病面積0.902**0.844**1發(fā)病相對面積0.966**0.902**0.867**1注：**表示在0.01水平上差異顯著。Note:**indicatedthesignificantlevelat0.01.參試自交系玉米穗腐病穗軸的抗性評價以發(fā)病邊長為抗性指標，對164份參試材料進行了抗性評價(表5)，結合穗軸抗性評價標準，從中篩選出58份高抗自交系與75份抗病自交系，而18份自交系鑒定為中抗，另外13份自交系鑒定為感病或高感。其中，CML27、BT-1、CML274、CML153、(BT-N6)RIL225、CML85、CML492、CML473、CML333、CML181、CML173、CML288、CML421、CML304、CML193等自交系抗性突出，具有潛在的利用價值。表5供試材料的抗性評價Table5Resistantevaluationforthe164testmaterials抗性評價Evaluationofresistance材料(份)Material(number)發(fā)病邊長Surroundinginfectedlength高抗(HR)58PV<1.01抗(R)751.01<PV<1,99中抗(MR)181.99<PV<2,96感⑸52.96<PV<3.94高感(HS)83.94<PV進一步對參試材料進行類群分析，結合抗性鑒定結果發(fā)現，164份玉米自交系中來自CIMMYT的熱帶、亞熱帶自交系占97份，其中高抗自交系45%，抗病及中抗自交系50%，而感與高感自交系僅有5%，這說明在取樣上熱帶、亞熱帶自交系偏多，CIMMYT的熱帶、亞熱帶自交系擁有豐富的穗軸抗病資源。玉米籽粒與穗軸對擬輪枝鐮孢菌抗性的比較結合玉米穗腐病籽?？剐澡b定結果，將穗軸與籽粒對擬輪枝鐮孢菌抗性結果進行比較(表8)，發(fā)現多數自交系抗性鑒定結果一致，如籽粒和穗軸均高抗自交系BT-1、CML173、CML193等；均高感自交系N6、XI502、12H577-1-Reid6等，但有些自交系鑒定結果不一致，如穗軸抗病籽粒感病的自交系CML244、5H10-1、772-2-1-1,穗軸感病籽?？共〉淖越幌?BT-N6)RIL64、10H1-1、276。這說明玉米籽粒與穗軸對擬輪枝鐮孢菌的抗性機制并

不一致，玉米果穗不同組織（籽粒與穗軸）對真菌抗性的差異反映出玉米穗腐病抗性機制的復雜性。選擇穗軸與籽粒均抗的材料并挖掘利用雙抗的基因資源，才能夠有效防止穗腐病的發(fā)生。表8籽粒與穗軸對擬輪枝鐮孢菌的抗性評價Table8EvaluationofkernelandcobresistancetoFusariumverticillioide自交系穗軸抗性籽?？剐訧nbredlineCobresistanceKernelresistanceBT-1HRHRCML173HRHRCML193HRHRCML182HRHR12H378-1HRHRCML497HRHRCML169HRHRCML312HRHRN6HSHSXI502HSHS12H577-1-Reid6HSHS12H560-1-TSPT10HSHS12H666-1-Reid20HSHSCML244HRHS12H650-1-TSPT4HRHS12H569-1-TSPT26HRHS(BT-N6)RIL64HSHR12H690-1-PB1HSHR2397-276HSHR2.5玉米穗腐病穗軸接種與鑒定體系的優(yōu)化隨著對穗軸抗性研究的逐步深入，進一步對穗軸接種和鑒定體系進行了優(yōu)化。用手持電鉆進行鉆孔，再將菌液注射到穗軸內，有效提高了穗軸接種效果。其次，通過鑒定指標的分析，發(fā)現病原菌侵染穗軸的發(fā)病芯長和發(fā)病邊長重疊，將兩個調查指標合二為一，將病原菌在穗軸侵染的縱向長度定義為發(fā)病長度。應用改良的接種方法以及優(yōu)化的抗性指標進行研究，利用抗感存在顯著差異的自交系BT-1（抗）和西502（感）構建分離群體，對發(fā)病長度和發(fā)病相對面積2個抗性指標的變異系數進行比較（表9），發(fā)現新的抗病指標發(fā)病長度可以更好地區(qū)分分離群體中不同材料間的抗感差異。表9分離群體中2個指標的均值和變異系數Table9Meanandcoefficientofvariationoftwoevaluationindexesinthesegregationpopulation指標 平均 標準差 變異系數—Index Mean Standarddeviation CV

發(fā)病長度

相對發(fā)病面積4.2787950.3624962.563555發(fā)病長度

相對發(fā)病面積4.2787950.3624962.5635550.2035690.599130.5615763.結論與討論通過對164份材料人工接種擬輪枝鐮孢菌，進行玉米穗腐病穗軸抗性研究，發(fā)現發(fā)病長度不僅能夠較大程度地反映出不同材料間的抗性差異，而且能夠降低試驗誤差提高重演性，可以作為穗軸抗性評價的指標。利用較為完善的抗性鑒定體系進行抗性評價，篩選出58份高抗自交系，血緣追蹤發(fā)現這些自交系多屬于熱帶、亞熱帶材料。結合前期進行的籽?？剐栽u價結果，發(fā)現籽?？剐耘c穗軸抗性不一致的現象，并篩選出8個籽粒與穗軸均抗的優(yōu)異抗源，為抗穗腐病玉米新品種的選育以及遺傳研究奠定了基礎。通過對接種體系的完善和鑒定體系的建立，在接種30天后進行調查。但是材料間生育時期存在差異，為了減小試驗誤差，應按照材料生育期進行分批接種和抗性鑒定；同時，應在多個時期進行有效防蟲，避免因蟲害引發(fā)穗腐病和蛀蝕穗軸而影響試驗。國內外對玉米穗腐病抗性研究多集中在籽?？剐?、種子抗性和花絲抗性上，對穗軸抗性研究較少。不同玉米自交系的花絲、籽粒和穗軸對擬輪枝鐮孢菌的抗性不同［16］。本研究組以穗軸、籽粒高抗穗腐病的自交系BT-1,穗軸高感穗腐病的自交系西502及熊掌為材料，進行了穗軸抗性遺傳研究，已鑒定出4個QTL,分別位于第2、3、4、6染色體［17］。在此基礎上，利用NIL群體對主效QTLqRcfv2進行了精細定位，把定位區(qū)間縮小到標記mcfv8和M2-4之間，結合關聯分析結果，初步確定了兩個候選基因GRMZM2G153268和GRMZM2G027049［10］。通過轉錄組分析初步確定候選基因GRMZM2G010909，推測該基因在響應機械損傷或病原體侵染過程中，以修復受損組織和產生次生代謝物,并修飾細胞壁結構,形成真菌傳播的屏障［18］。茉莉酸在禾本科植物防御病原真菌中起著重要作用［19］。這些研究多致力于挖掘抗性QTL，而QTL的鑒定依賴于群體標記密度以及表型鑒定的準確性。隨著測序技術的發(fā)展，對標記的開發(fā)利用變得越來越便利快捷，而對表型進行精準鑒定成為QTL研究的重要環(huán)節(jié)。玉米穗腐病的發(fā)生具有不同的侵染途徑，而且存在組織特異性，同時也是一種遺傳力較低、易受環(huán)境影響的數量性狀。將玉米對穗腐病抗性剖分為穗軸抗性和籽粒抗性，可從不同的角度加深對穗腐病抗性機制的認識。玉米穗軸對擬輪枝鐮孢菌抗性指標的建立及抗病種質資源的篩選，有益于準確鑒定表型與篩選穗軸高抗穗腐病的自交系及品種，為穗軸抗性遺傳研究過程中表型的準確鑒定提供保障。本研究組正在進行穗軸特異抗性QTL與候選基因的功能驗證以及網絡調控機制的研究，并通過候選基因的關聯分析，挖掘優(yōu)良等位變異及最優(yōu)單倍型，深入解析玉米穗腐病穗軸抗性遺傳機制，并為分子育種提供優(yōu)異抗源、抗性基因以及功能標記，最終服務于玉米抗病育種工作。參考文獻：［1］裴冬麗,劉春元,吳建宇,等.河南省玉米穗粒腐病病原串珠鐮刀菌鑒定［J］.玉米科學，2011,19(1):136-138.PeiDL,LiuCY,WuJY,etal.TheIdentificationofPathogenFusariumVerticillioidesCausingMaizeEarRotinHenan[J].JournalofMaizeScience,2011,19(1):13-1638.(inChinese)[2]趙清爽，席靖豪,袁虹霞，等.不同殺菌劑對兩種玉米穗粒腐病菌的室內毒力測定[C].中國植物病理學會2017年學術年會,2017:1.[3]陳捷.我國玉米穗、莖腐病病害研究現狀與展望J],沈陽農業(yè)大學學報,2000,31(5):393-401.ChenJ.StatusandPerspectiveonResearchofEarRotandStalkRotinMaize[J].JournalofShenyangAgriculturalUniversity,2000,31(5):393-401.[4]蓋曉彤.玉米莖腐病與穗腐病致病鐮孢菌侵染途徑及其致病力差異研究[口].沈陽農業(yè)大學,2018.[5]方胄,吳秀艷,楊英娟，等.玉米穗、莖腐病致病串珠鐮孢菌的侵染循環(huán)關系研究J],雜糧作物2005,25(2):96-97.FangW,WuXY,YangYJ,etal.StudyontheInfectionCycleofPathogeneticF.moniliformeofMaizeEarRotandMaizeStalkRot[J].RainFedCrops,2005,25(2):96-97.(inChinese)[6]MillerSS,ReidLM,HarrisLJJCJOB.ColonizationofMaizeSilksbyFusariumgraminearum,theCausativeOrganismofGibberellaEarRot[J].CanadianJournalofBotany,2010,85(4):369-376.[7]DesjardinsAE,MaragosCM,ProctorRH,etal.MaizeEarRotandMoniliforminContaminationbyCrypticSpeciesofFusariumsubglutinans[J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2006,54(19):7383-90.[8]OldenburgE,EllnerFJMR.DistributionofDiseaseSymptomsandMycotoxinsinMaizeEarsInfectedbyFusariumculmorumandFusariumgraminearum[J].MycotoxinResearch,2015,31(3):1-10.[9]MoralesL,ZilaCT,MoretaMejiaDE,etal.DiverseComponentsofResistancetoFusariumverticillioidesInfectionandFumonisinContaminationinFourMaizeRecombinantInbredFamilies[J].Toxins,2019,11(2):86.[10]MuC,GaoJ,ZhouZ,etal.GeneticanalysisofcobresistancetoF.verticillioides:anothersteptowardstheprotectionofmaizefromearrot[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2019,132:1049-1059.[11]陳玉娜.玉米穗粒腐病主效抗病QTL分析及其抗性機理研究[口].河南農業(yè)大學,2014.[12]馬秉元，李亞玲,龍書生，等.玉米穗粒腐病接種技術及品種抗病性鑒定[J].植物保護學報，1999,(02):121-124.MaBY,LiYL,LongSS,etal.InoculationTechniqueofCornKernelorEarRotandIdentificationofVarietyResistance[J].ActaPhytophylacicaSinica,1999,(02):121-124.(inChinese)[13]王麗娟，徐秀德，劉志恒，等.玉米抗鐮刀菌穗腐病接種