8356733-張耀全-半干旱雨養(yǎng)區(qū)苜蓿種植年限影響黃綿土N2O排放的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制

摘要紫花苜蓿因其優(yōu)良的飼用價(jià)值和生態(tài)功能，在黃土高原環(huán)境建設(shè)和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中發(fā)揮著重要作用。針對(duì)目前黃綿土區(qū)苜蓿草地N2O釋放的微生物機(jī)理研究較少的現(xiàn)狀，本研究以黃土高原半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)不同年齡紫花苜蓿人工草地為研究對(duì)象，于2018-2019年采用靜態(tài)箱-氣相色譜法測(cè)定了不同種植年限（L2003、L2005、2012）苜蓿物候期N2O釋放通量，同時(shí)借助基于MiSeq平臺(tái)的高通量分子生物學(xué)測(cè)序技術(shù)測(cè)定了土壤氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）群落結(jié)構(gòu)和豐度。通過(guò)研究不同種植年限紫花苜蓿土壤N2O排放動(dòng)態(tài)和土壤中氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)、豐度及其多樣性及群落，解析黃土高原苜蓿草地系統(tǒng)土壤N2O排放的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制，為西部黃土高原苜蓿草地的合理利用和雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)生產(chǎn)力可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。主要研究結(jié)論如下：（1）黃土高原半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)苜蓿土壤為N2O排放源，并呈現(xiàn)出夏秋高春冬低的季節(jié)性變化規(guī)律；N2O排放通量呈現(xiàn)出明顯的單峰變化趨勢(shì)，并于二茬再生期（7月）達(dá)到排放峰值，排放通量分別為0.1679mg·m-2·h-1（2018）和0.1715mg·m-2·h-1（2019）；隨苜蓿種植年限的延長(zhǎng)，累積排放量及增溫潛勢(shì)增加。（2）半干旱黃綿土區(qū)苜蓿土壤AOA和AOB的豐度分別為6.14×106~12.68×106copies·g-1干土和0.27×106~7.7×106copies·g-1干土，表現(xiàn)為AOA豐度顯著高于AOB；隨苜蓿種植年限延長(zhǎng)AOA群落豐度增加顯著，但AOB豐度表現(xiàn)為先增加后降低；長(zhǎng)期種植苜蓿顯著降低土壤AOA群落多樣性并提高其豐富度，但對(duì)AOB群落多樣性和豐富度無(wú)明顯影響。（3）半干旱黃綿土區(qū)苜蓿土壤AOA群落優(yōu)勢(shì)門（>1%）為泉古菌門（Crenarchaeota）和unclassified_norank_Archaea，相對(duì)豐度分別為51.50%-96.16%和3.80%-47.13%；優(yōu)勢(shì)屬（>1%）為norank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota、unclassified_k__norank_d__Archaea和norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota，相對(duì)豐度為51.50%-96.16%、3.80%-47.13%和0.04%-1.10%（4）半干旱黃綿土區(qū)苜蓿土壤AOB群落優(yōu)勢(shì)門為變形菌門、unclassified_k__norank_d__Bacteria和ammonia_oxidising_bacteria_ensemble，相對(duì)豐度分別為45.28%-67.73%、20.92%-28.01%和10.96%-31.58%，長(zhǎng)期種植苜蓿后顯著增加變形菌門的相對(duì)豐度，并降低ammonia_oxidising_bacteria_ensemble的相對(duì)豐度；優(yōu)勢(shì)屬為亞硝化螺菌屬、unclassified_k__norank_d__Bacteria、norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensemble、unclassified_o__Nitrosomonadales和norank_f__environmental_samples，其豐度分別為21.11%-52.01%、17.83%-28.01%、10.96%-31.58%、10.95%-23.07%和2.56%-15.96%，隨苜蓿種植年限的延長(zhǎng)而增加，亞硝化螺菌屬相對(duì)豐度顯著增加，norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensembl相對(duì)豐度顯著降低。（5）RDA分析結(jié)果表明，土壤有機(jī)碳（P=0.004）、硝態(tài)氮（P=0.025）、微生物量碳（P=0.013）、微生物量氮（P=0.048）和脲酶（P=0.005）是影響AOA群落結(jié)構(gòu)的主要因素；土壤NH4+-N（P=0.014）和微生物量碳（P=0.037）是影響AOB群落結(jié)構(gòu)的主要因素。（6）N2O排放通量同時(shí)受到環(huán)境因素和生物因素的共同影響，其中土壤溫度、SOC、TN、NO3--N、MBC和pH是影響半干旱黃綿土區(qū)苜蓿土壤N2O排放通量的環(huán)境因素；AOA群落的norank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota、unclassified_k__norank_d__Archaea、norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota和norank_p__environmental_samples_k__norank及AOB群落的unclassified_k__norank_d__Bacteria影響黃綿土N2O排放通量的主要生物因子。關(guān)鍵字：黃綿土，紫花苜蓿，N2O排放通量；氨氧化古菌；氨氧化細(xì)菌；SummaryAlfalfaplaysanimportantroleinenvironmentconstructionandindustrialstructureadjustmentbecauseofitsexcellentfeedingvalueandecologicalfunctioninLoessPlateau.InviewofthestudyonmicrobiologicalmechanismofN2Oemissionofalfalfainloessialsoilisless,so,thisstudytookthealfalfawithdifferentgrowthyearsinsemi-aridrain-fedagriculturalareainLoessPlateauasresearchobject,staticchamber-gaschromatographictechniqueswereusedtocontinuouslymeasureandanalyzetheN2Ofluxesofalfalfawithdifferentgrowthyear(L2003,L2005,L2012)during2018to2019,quantitativePCRandIlluminaMiSeqhigh-throughputsequencingwereappliedtoinvestigateabundance,communitystructure,anddiversityofammonia-oxidizingarchaea(AOA)andammonia-oxidizingbacteria(AOB)inloessialsoilwithcontinuousalfalfagrowing.ThroughthestudyofN2Oemissiondynamicandtheabundance,diversity,communitystructureofAOAandAOBofalfalfasoilwithdifferentgrowthyears,torevealthesoilN2Oemissionofmicrobialdrivemechanism,inordertoprovidescientificbasisandeffectivetheoryreferenceforlucernelandrationalutilizationonwesternLoessPlateauandproductivitysustainabledevelopmentonrainfedagriculturalarea.Theresearchmainconclusionsareasfollows:TheAlfalfasoilinthesemi-aridrain-fedagriculturalareaoftheLoessPlateauistheN2Oemissionsource,andpresentstheseasonalvariationcharacteristicsofsummerandautumnarehigherthanspringandwinter.TheN2OemissionfluxshowedanobvioustrendofunimodalvariationandreacheditspeakinJuly,theemissionfluxswere0.1679mg·m-2·h-1(2018)and1715mg·m-2·h-1(2019),Withtheextensionofalfalfagrowthyears,thecumulativeemissionsandthewarmingpotentialgraduallyincreased,whichwasshownasL2003>L2005>L2012.ComparewithL2005andL2012,ThecumulativeemissionsandthewarmingpotentialweresignificantlygreaterinL2003thaninL2005andL2012,high4.47%and14.14%.TheabundanceofAOAandAOBinalfalfasoilwere6.14×106-12.68×106copies·g-1drysoiland0.27×106-7.7×106copies·g-1drysoil,andbothdecreasedgraduallywiththedeepeningofsoillayers.Withtheincreaseofalfalfagrowthyears,theAOAabundanceineachsoillayerwasL2003>L2005>L2012,andtheAOBabundancewasL2005>L2003>L2012,andweresignificantlycorrelatedwithsoiltotalnitrogen,nitratenitrogen,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandureaseactivity.(3)TherichnessanddiversityofAOAandAOBinalfalfasoilonLoessPlateauincreasedwiththedeepeningofsoillayer.Withtheextensionofalfalfagrowthyears,thediversityofAOAinthe0-30cmsoillayershowedL2003>L2005>L2012,andShannonindexbyL2012wassignificantlyhigherthanthatofL2003(P<0.05);TherichnessshowedL2012>L2003>L2005,thediversityofAOBshowedL2005>L2003>L2012,therichnessshowedL2003>L2005>L2012.In30-60cmsoillayer,thediversityofAOAshowedL2005>L2003>L2012,therichnessshowedL2012>L2003>L2005;ThediversityofAOBshowedL2012>L2005>L203,andtherichnessshowedL2003>L2012>L2005.CorrelationanalysisfoundthatthediversityofAOAandAOBweresignificantlycorrelatedwithsoilorganiccarbon,nitratenitrogen,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandurease.Long-termcultivationofalfalfadidnotsignificantlyaffectthediversityofAOB.(4)Thedominantphylum(>1%)ofAOAwereCrenarchaeotaandunclassified_norank_Archaea,withrelativeabundanceof51.50%-96.16%and3.80%-47.13%,respectively.Thedominantgenera(>1%)werenorank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota,unclassified_k__norank_d__Archaeaandnorank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota,withrelativeabundanceof51.50%-96.16%,3.80%-47.13%and0.04%-1.10%.Soilnitrate,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandureaseactivitieswerethemainfactorsaffectingAOAcommunitygeneragroups.Therelativeabundanceofalfalfawasnotsignificantlychangedaftercontinuousalfalfagrowing.Thedominantphylum(>1%)ofAOBwereProteobacteria,unclassified_k__norank_d__Bacteriaandammonia_oxidising_bacteria_ensemble,withtherelativeabundanceof45.28%-67.73%,20.92%-28.01%and10.96%-31.58%,respectively.Withtheincreaseofalfalfagrowthyears,therelativeabundanceofProteobacteriawassignificantlyincreased,andtherelativeabundanceofammonia_oxidising_bacteria_ensemblewassignificantlydecreased.ThedominantgenerawereNitrosospira,unclassified_k__norank_d__Bacteria,norank_p__ammonia_oxidising_bacteria_ensemble,unclassified_o__Nitrosomonadalesandnorank_f__environmental_samples,withtherelativeabundanceof21.11%-52.01%,17.88%-28.01%,10.96%-31.58%,10.95-23.07%and2.566-15.96%,whichweremainlyaffectedbytotalnitrogen,organiccarbon,microbialbiomasscarbon,microbialbiomassnitrogenandpH.Withtheextensionofalfalfagrowthyears,therelativeabundanceofNitrosospiraincreasedgradually,andtherelativeabundanceofnorank_psamammonia_oxidising_bacteria_ensembldecreasedgradually.(5)RDAanalysisresultsshowthatthesoilorganiccarbon(P=0.004)andurease(P=0.005)werethemostimportantfactorsinfluencingtheAOAcommunitystructure,soilnitritenitrogen(P=0.025),microbialbiomasscarbon(P=0.013)andmicrobialbiomassnitrogen(P=0.048)werethesecondaryfactorsinfluencingtheAOAcommunitystructure,soilammoniumnitrogen(P=0.014)andthemicrobialbiomasscarbon(P=0.037)werethemainfactorsinfluencingtheAOBcommunitystructure.(6)N2Oemissionisaffectedbybothenvironmentalandbiologicalfactors.Soiltemperature,totalnitrogen,soilorganiccarbon,microbialbiomasscarbonnitritenitrogenandpHareenvironmentalfactorsthataffectedN2Oemission,andthenorank_c__environmental_samples_p__Crenarchaeota,unclassified_k__norank_d__Archaea,norank_c__environmental_samples_p__Thaumarchaeota,norank_p__environmental_samples_k__norankofAOAcommunityandtheunclassified_k__norank_d__BacteriaofAOBcommunityarebiologicalfactorsthataffectedN2Oemission.KeyWords：N2O；Ammonia-oxidizingarchaea；Ammonia-oxidizingbacteria；Abundance；Communitystructure目錄摘要 IISummary IV第一章緒論 11.1研究背景 11.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 31.2.1苜蓿人工草地N2O排放研究 31.2.2N2O排放的環(huán)境影響因子 31.2.3土壤微生物介導(dǎo)的N2O排放研究 61.3研究?jī)?nèi)容 71.3.1黃土高原不同種植年限苜蓿草地溫室氣體排放特征 71.3.2土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 71.3.3苜蓿種植年限影響黃綿土N2O排放的機(jī)制 71.4技術(shù)路線 8第二章．材料與方法 82.1試驗(yàn)區(qū)概況 82.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 92.3測(cè)定指標(biāo)及方法 92.3.1土壤溫室氣體的采集與測(cè)定 102.3.2土壤理化性狀的測(cè)定 102.3.3土壤酶活性的測(cè)定 102.3.4土壤氨氧化微生物豐度及群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定 102.4主要計(jì)算方法 112.4.1溫室氣體排放通量的測(cè)定 112.4.2溫室氣體累積排放量 122.4.3增溫潛勢(shì)（GWP） 122.4.4多樣性指數(shù)計(jì)算方法 122.5數(shù)據(jù)處理 14第三章．結(jié)果與分析 153.1黃土高原不同種植年限苜蓿草地N2O排放特征 153.1.1不同種植年限苜蓿土壤N2O排放的季節(jié)動(dòng)態(tài) 153.1.2N2O累積排放量和增溫潛勢(shì) 163.2土壤理化性質(zhì)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 173.2.1土壤水分對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 173.2.2土壤溫度對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 183.2.2土壤養(yǎng)分對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 193.2.3土壤微生物量碳、氮和酶活性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 203.3土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 213.3.1土壤AOA群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 21土壤AOA豐度對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 21土壤AOA多樣性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 21土壤AOA群落結(jié)構(gòu)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 223.3.2土壤AOB群落結(jié)構(gòu)和多樣性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 26土壤AOB豐度對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 26土壤AOB多樣性對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 26土壤AOB群落結(jié)構(gòu)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng) 273.3.3土壤理化因子對(duì)氨氧化微生物群落的影響 31土壤氨氧化微生物群落多樣性與土壤理化因子相關(guān)性分析 31土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子相關(guān)性分析 32冗余（RDA）分析 343.4苜蓿種植年限影響黃綿土N2O排放的機(jī)制 363.4.1N2O排放通量與土壤物理性質(zhì)的回歸分析 363.4.2N2O排放通量與土壤因子相關(guān)分析 373.4.3N2O排放與土壤氨氧化微生物群落的相關(guān)分析 39第四章討論與結(jié)論 414.1討論 414.1.1種植年限對(duì)苜蓿土壤N2O排放的影響 414.1.2種植年限對(duì)苜蓿土壤氨氧化微生物群落特征的影響 424.1.3苜蓿種植年限影響黃綿土N2O排放的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制 444.2結(jié)論 44參考文獻(xiàn) 46致謝 56作者簡(jiǎn)介 57導(dǎo)師簡(jiǎn)介 58第一章緒論1.1研究背景聯(lián)合國(guó)環(huán)境規(guī)劃署2019年發(fā)布的第10份排放差距報(bào)告顯示[1]，2018年度的溫室氣體排放總量達(dá)到了歷史以來(lái)的最高點(diǎn)，約為553億噸，要實(shí)現(xiàn)《巴黎協(xié)定》目標(biāo)所允許的溫室氣體排放水平，現(xiàn)在比以往任何時(shí)候都更迫切需要所有國(guó)家采取緊急行動(dòng)，實(shí)現(xiàn)大幅度減排。近100年以來(lái)，干旱半干旱區(qū)溫度增加最明顯的地區(qū)，尤其是半干旱地區(qū)對(duì)全球變暖的貢獻(xiàn)達(dá)到了44%。氧化亞氮（N2O）作為地球上三大主要的對(duì)流層溫室氣體之一，其輻射增溫效應(yīng)約分別占溫室氣體16%，它參與地球生態(tài)系統(tǒng)中的氮循環(huán)ADDINCNKISM.Ref.{F38998738B524e98B4EE60138AD3328D}[2-3]。N2O是大氣中三種主要溫室氣體中濃度最低的，但其增溫效應(yīng)最高，約為CO2的50～200倍ADDINCNKISM.Ref.{C0BD9E542743461689C2406A5C5BDABD}[4]。N2O能在大氣中停留很長(zhǎng)時(shí)間，對(duì)環(huán)境的影響存在潛伏性和長(zhǎng)期性ADDINCNKISM.Ref.{4A2064FA8962434a8F64C1A251B9182B}[5]，此外N2O還能與空氣中的物質(zhì)反應(yīng)形成光化學(xué)煙霧，從而破壞臭氧層，因此，其也被認(rèn)為是一種破壞大氣中臭氧層的重要物質(zhì)ADDINCNKISM.Ref.{FB648333BCD94251AF08421618A335B1}[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，如果大氣中的N2O濃度增加一倍，將破壞大氣中約10%的臭氧層，導(dǎo)致穿過(guò)臭氧層的紫外線輻射顯著增加，而達(dá)到地表的紫外線過(guò)多就會(huì)對(duì)人類身體健康產(chǎn)生不利影響ADDINCNKISM.Ref.{2F55FD2A74C74d1cA746C4FAE503A30D}[7-8]。普遍認(rèn)為大氣環(huán)境中的N2O大約有70%是自然排放的，剩余的30%主要是化石燃料的燃燒等人類活動(dòng)產(chǎn)生的，而自然產(chǎn)生的N2O就包括有農(nóng)田土壤、草地、森林排放出來(lái)的N2O，而農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中80%的N2O排放量主要是由于氮素利用不合理導(dǎo)致的ADDINCNKISM.Ref.{F1F2E8559C614588A20DCF37871CB0F3}[9-12]。控制土壤中N2O排放的過(guò)程包括硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程，均是由微生物參與作用，而硝化過(guò)程中的氨氧化過(guò)程是土壤中氮循環(huán)的限速步驟，主要是在氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）的參與下完成ADDINCNKISM.Ref.{45BC83263B624be78C9382BCCFC0D40F}[13]。黃土高原屬于典型的半旱地農(nóng)業(yè)區(qū)，區(qū)內(nèi)溝壑縱橫、地形破碎，水資源嚴(yán)重缺乏。此外，黃土高原土壤類型為黃綿土，質(zhì)地松軟，抗沖蝕能力差，由于干旱少雨，導(dǎo)致地上植被稀疏，覆蓋率低，導(dǎo)致其生態(tài)環(huán)境十分脆弱ADDINCNKISM.Ref.{CF5BB435B3C04c9e83A8D32E01172B8D}[14]。紫花苜蓿(Medicagosativa)是我國(guó)人工草地種植面積最大的草種,具有抗旱、耐寒、耐貧瘠、保持水土、產(chǎn)量高等優(yōu)良特性和較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性，而且還具有土壤改良、培肥地力、植物修復(fù)等眾多生態(tài)功能ADDINCNKISM.Ref.{CE4BDF1D91EF456dA687FFED8E390827}[15-16]，其根系經(jīng)根瘤菌侵染形成根瘤后能固定空氣中的游離氮，增加土壤中的氮素含量，據(jù)估算，每公頃苜蓿草地每年可以從大氣中固定35～305kgN素，遠(yuǎn)高于其他作物地和天然草地，在我國(guó)半干旱地區(qū)，每公頃苜蓿1年可在土壤中固定270kg氮，相當(dāng)于825kg硝酸銨ADDINCNKISM.Ref.{ECD511F5156B4dd987442D34FA40B69A}[17]。紫花苜蓿由于抗逆性強(qiáng)，長(zhǎng)期以來(lái)一直是該地區(qū)生態(tài)恢復(fù)的首選牧草，對(duì)西北旱地農(nóng)業(yè)生態(tài)脆弱區(qū)的生態(tài)修復(fù)、土壤結(jié)構(gòu)改善、土壤肥力增強(qiáng)、水土保持等有著重要作用，因此在黃土高原地區(qū)種植面積逐年擴(kuò)大ADDINCNKISM.Ref.{7D440B2D1BD54ac3B66768AE84E0C84F}[18]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，甘肅省豆科牧草的種植面積為758000hm2，其中紫花苜蓿種植面積約529000hm2，占國(guó)內(nèi)總種植面積的三分之一，居全國(guó)首位ADDINCNKISM.Ref.{03382187D09947ce886F9D2FCC3C966F}[19]。目前，關(guān)于多年生苜蓿草地的研究大都集中在水分恢復(fù)效應(yīng)[17]和養(yǎng)分變化[15-16]等方面，對(duì)苜蓿土壤溫室氣體排放研究也局限于土壤水分、溫度等土壤理化的角度[2,9-10]，而基于微生物視角開展苜蓿土壤溫室氣體排放的研究相對(duì)匱乏。土壤微生物是土壤有效養(yǎng)分重要的庫(kù)源和轉(zhuǎn)化者，是土壤中的活性組分，每克土壤中棲息著大約100億個(gè)微生物[20]，幾乎所有的土壤生物化學(xué)過(guò)程都直接或間接地與土壤微生物有關(guān)。土壤微生物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能如土壤結(jié)構(gòu)維持、有機(jī)物質(zhì)的分解和養(yǎng)分循環(huán)、溫室氣體排放等發(fā)揮著重要作用[21]。同時(shí)，土壤微生物能夠迅速對(duì)周圍環(huán)境的變化做出反應(yīng)，是表征土壤質(zhì)量變化最敏感、最有潛力的指標(biāo)[22]。氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizingbacteria，AOB）和氨氧化古菌（Ammonia-oxidizingArchaea，AOA）在氨單加氧酶和羥胺氧化還原酶的催化下，將NH3氧化成NO2，是硝化作用的關(guān)鍵步驟，也是限速步驟[23]，該過(guò)程的中間產(chǎn)物NH2OH會(huì)發(fā)生化學(xué)分解而釋放出N2O。研究表明，在35%～60%孔隙含水率（Waterfilledporespace，WFPS）時(shí)硝化作用是土壤N2O排放的主要來(lái)源[24]。本研究依托布設(shè)在甘肅省定西市安定區(qū)李家堡鎮(zhèn)的甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱地農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站的長(zhǎng)期定位試驗(yàn)，測(cè)定生育期和休閑期不同種植年限苜蓿土壤N2O氣體排放動(dòng)態(tài)，同時(shí)采用定量PCR和IlluminaMiSeq高通量測(cè)序分析不同種植年限的苜蓿土壤AOA和AOB的豐度、多樣性以及群落結(jié)構(gòu)，探討N2O排放通量與其相關(guān)非生物因素和生物因素的偶聯(lián)關(guān)系，明確影響N2O排放的主控因子，解析黃土高原不同種植年限苜蓿地N2O排放的微生物學(xué)驅(qū)動(dòng)機(jī)制。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1苜蓿人工草地N2O排放研究農(nóng)業(yè)土壤作為N2O氣體的重要排放源，釋放量占全球總量的70%～90%ADDINCNKISM.Ref.{B3554894DC164936832BF8DA9CA8D77F}[3]。其產(chǎn)生途徑包括反硝化作用、硝化作用、硝化微生物的反硝化作用及硝酸鹽異化還原成銨等作用，其中硝化作用和反硝化作用是農(nóng)業(yè)土壤產(chǎn)生N2O的最主要途徑ADDINCNKISM.Ref.{3A9C586F18A148e2BD8A35FC626BA57E}[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)[27]，氧化亞氮排放通量有著明顯的季節(jié)變化規(guī)律，不同作物在不同生育期排放的N2O量也不相同。段翠清等ADDINCNKISM.Ref.{766AB84DC9034b718EE52713C22E682E}[27]對(duì)隴中黃土高原8年苜蓿地生育期N2O的排放動(dòng)態(tài)研究表明，土壤對(duì)N2O呈吸收排放狀態(tài)，苜蓿地N2O的變化范圍為0.02-0.11mg·m-2·h-1，苜蓿地的綜合增溫潛勢(shì)顯著低于農(nóng)田的綜合增溫潛勢(shì)。王濤ADDINCNKISM.Ref.{03B44B48D878424b89EBFC5E9AA4894E}[28]等對(duì)黃土高原旱塬區(qū)隴東苜蓿草地N2O釋放動(dòng)態(tài)研究表明，從返青期至越冬期，3年齡隴東苜蓿草地N2O釋放通量在-0.099～0.085mg·m-2·h-1間，并呈上升－下降－上升－下降的變化趨勢(shì)，遠(yuǎn)低于濕地生態(tài)系統(tǒng)和國(guó)際釋放平均水平0.627mg·m-2·h-1。因此，旱塬區(qū)隴東苜蓿草地是較弱的N2O排放源。徐坤ADDINCNKISM.Ref.{0523C33A32BD411eAA41ABB504CD8EA6}[29]對(duì)寧夏地區(qū)不同種植年限苜蓿地溫室氣體排放通量研究發(fā)現(xiàn)，不同種植年限苜蓿地土壤植被系統(tǒng)與土壤系統(tǒng)的N2O通量排放趨勢(shì)基本一致，呈現(xiàn)出“夏秋高冬季低”的季節(jié)變化規(guī)律，總體表現(xiàn)為：4a>5a>3a>8a>1a，并且在5月和8月中旬各出現(xiàn)了N2O排放峰值，表現(xiàn)出的“源”效應(yīng)。N2O排放通量受到種植年限的影響，排放最高值出現(xiàn)在4年生的苜蓿地中，而排放最低值出現(xiàn)在1年生的苜蓿地中。1.2.2N2O排放的環(huán)境影響因子土壤質(zhì)地通過(guò)影響土壤的通氣狀況及土壤含水量，從而影響到土壤中硝化潛勢(shì)和反硝化潛勢(shì)，以及氧化亞氮在土壤中的擴(kuò)散速率，同時(shí)土壤有機(jī)物質(zhì)的分解速率也與土壤質(zhì)地息息相關(guān)，其通過(guò)影響產(chǎn)生氧化亞氮的底物供應(yīng)進(jìn)而影響到土壤中的氧化亞氮排放[30]。目前土壤質(zhì)地對(duì)旱地農(nóng)田土壤氧化亞氮排放通量的影響已有一些研究[31-32]。對(duì)旱地農(nóng)田土壤氧化亞氮排放通量的研究發(fā)現(xiàn)由于重質(zhì)地土壤保水能力強(qiáng)，因此在該質(zhì)地旱地土壤中，氧化亞氮的排放通量較高，而在輕質(zhì)地的旱地土壤中，排放通量相對(duì)較低，這可能是因?yàn)橹刭|(zhì)地的旱地土壤具有更強(qiáng)的保水性能。徐華等[33]通過(guò)研究土壤質(zhì)地對(duì)農(nóng)田旱地土壤氧化亞氮的排放發(fā)現(xiàn)，不同土壤質(zhì)地的小麥和棉花地中，氧化亞氮排放通量表現(xiàn)為壤土最高，其次為沙土，粘土最低。土壤氧化亞氮排放量在不同質(zhì)地水田中略有不同，李良謨和伍期途[34]研究結(jié)果表明，在水稻苗期不同土壤質(zhì)地的氧化亞氮排放通量依次為紅壤型水稻土>潛育型水稻土>淹育型水稻土；徐華等[35]通過(guò)研究不同質(zhì)地土壤的氧化亞氮排放發(fā)現(xiàn)，沙質(zhì)稻田土壤中的氧化亞氮排放通量顯著高于壤質(zhì)和粘質(zhì)稻田土壤。此外，在不同質(zhì)地的土壤中施用氮肥對(duì)氧化亞氮排放的影響也有所不同，Mosier等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在粘質(zhì)壤土中，氧化亞氮排放通量對(duì)氮素的變化有著更敏感的響應(yīng)，在沙質(zhì)壤土中，氧化亞氮排放通量對(duì)氮素含量的變化沒有明顯的響應(yīng)。也有研究發(fā)現(xiàn)，在土壤孔隙含水量較高條件下，粘土氧化亞氮排放的增加是由于粘質(zhì)土壤的溫度系數(shù)Q10比沙質(zhì)土壤大，促進(jìn)了反硝化作用[37]。土壤溫度通過(guò)影響土壤內(nèi)部微生物活性、硝化和反硝化速率以及N2O傳送速率等多方面，進(jìn)而左右土壤N2O的排放ADDINCNKISM.Ref.{4D0FB0D55A80425fB57C18306A9ADD19}[38]。有研究表明ADDINCNKISM.Ref.{C31A8D145A674af6B23361FAA5BB197B}[39]，苜蓿地N2O排放通量與5cm地溫呈線性函數(shù)關(guān)系，土壤N2O排放通量發(fā)生的頻率呈現(xiàn)正態(tài)分布，15-25度范圍內(nèi)集中了67%的排放量ADDINCNKISM.Ref.{EC700CC493924823820374795E390D61}[40]。另外，溫度對(duì)土壤N2O排放通量的影響隨土壤深度增加而逐漸減弱ADDINCNKISM.Ref.{9EA7584B69704e3dBC4CC229605C741C}[41]，溫度過(guò)低時(shí)，土壤主要表現(xiàn)為對(duì)N2O的吸收。高琳等ADDINCNKISM.Ref.{BFF5A4E348AF4e11BCDBF29B54A9C22E}[42]對(duì)馬鈴薯地溫室氣體排放量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯田N2O排放通量分別與采氣時(shí)段土壤5cm、15cm和25cm的溫度均呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，這可能與N2O的季節(jié)排放規(guī)律和溫度的季節(jié)性變化有關(guān)。土壤水分主要通過(guò)影響土壤通氣狀況、土壤的氧化還原狀況以及土壤中微生物的活性來(lái)影響土壤N2O的排放。有研究表明ADDINCNKISM.Ref.{F5274F40D299458b9FF539E8484B91DC}[43]，孔隙含水率在35%～60%時(shí)，硝化作用是土壤N2O排放的主要來(lái)源，而在土壤孔隙含水率為70%時(shí)，所有的N2O排放量均來(lái)自于反硝化作用，但是當(dāng)土壤完全淹水時(shí)，由于反硝化作用進(jìn)行完全降低了土壤N2O的排放量。此外，干濕交替過(guò)程可引起土壤硝化作用和反硝化作用交替產(chǎn)生N2O，并且抑制N2O繼續(xù)還原為N2，從而促進(jìn)N2O的產(chǎn)生與排放。孫海妮ADDINCNKISM.Ref.{49BBD11A48D74516A3605D1B039AF35A}[44]在黃土高原半干旱區(qū)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)N2O排放峰均出現(xiàn)在施肥、降水雨或灌水后，這與宋麗娜ADDINCNKISM.Ref.{F936EA8C7FC84b74A14CBDBA786CD3AD}[45]的研究結(jié)果一致，這可能是灌水以后土壤由干變濕含水量增加，土壤進(jìn)行干濕交替，促進(jìn)硝化與反硝化作用釋放更多的N2O。大部分異養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)與繁殖均離不開土壤中的碳氮養(yǎng)分，因此土壤中的碳氮含量被認(rèn)為是是調(diào)控N2O排放的重要因子[46]，研究發(fā)現(xiàn)土壤碳氮含量與N2O排放通量之間都具有顯著正相關(guān)關(guān)系。因?yàn)橥寥廊c土壤有機(jī)質(zhì)有著直接的耦合關(guān)系，有機(jī)質(zhì)的含量對(duì)礦化作用有直接影響[47]，硝化和反硝化微生物在轉(zhuǎn)化土壤中的NH4+和NO3－時(shí)，需要吸收利用土壤中的碳氮養(yǎng)分作為能源，但土壤中的碳氮含量較高時(shí)，異養(yǎng)硝化和反硝化微生物活性增強(qiáng)，促進(jìn)了硝化和反硝化過(guò)程，從而產(chǎn)生大量的N2O[48]。此外，N2O通量還與氮的礦化速率有關(guān)[49]，隨著土壤全氮和有機(jī)質(zhì)含量的增加，N2O的排放通量增大。N2O釋放同時(shí)受硝化和反硝化作用過(guò)程的控制[50-51]，與土壤中硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的活性、數(shù)量和種類有關(guān)。植物種類也影響著N2O的釋放，豆科作物N2O的釋放量顯著高于非豆科作物[52]。豆科植物的生物固氮特性在增加植物可利用氮素的同時(shí)，也為硝化和反硝化過(guò)程提供了額外的底物，如大豆地N2O釋放量顯著高于玉米地[53]，加拿大農(nóng)業(yè)領(lǐng)域釋放的N2O中有22％來(lái)源于豆科作物[54]。袁紅朝等[55]發(fā)現(xiàn)土壤中有機(jī)碳含量的增加會(huì)促進(jìn)土壤中的反硝化微生物活性，導(dǎo)致土壤中排放的N2O增加。而且土壤C/N比也會(huì)影響氮素的轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而影響到N2O的排放。通常土壤C/N比為25～30時(shí)，微生物比較活躍，當(dāng)C/N比高于30時(shí)，有機(jī)碳分解速率下降，微生物活性逐漸降低，土壤N2O的排放受到抑制;當(dāng)C/N比低于25時(shí)，有機(jī)碳分解速率逐漸增加，微生物活性逐漸增強(qiáng)，使土壤N2O的排放速率逐漸增加[56]。土壤pH值可通過(guò)影響與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物的活性及改變相應(yīng)的氮素轉(zhuǎn)化過(guò)程而影響N2O的排放。研究發(fā)現(xiàn)，中性或弱堿性的土壤環(huán)境更適宜硝化和反硝化微生物的生存[57]，當(dāng)土壤堿性較強(qiáng)時(shí)，反硝化酶Nos的活性增強(qiáng)，然而當(dāng)土壤酸性較強(qiáng)時(shí)，反硝化酶Nos的活性逐漸降低，其他反硝化酶的活性增強(qiáng)，導(dǎo)致反硝化過(guò)程產(chǎn)生的N2O通量增加[58]；此外，當(dāng)土壤pH降低時(shí)，有機(jī)碳的分解速率也隨之降低[59]，減少了硝化和反硝化過(guò)程中消耗的氮素，從而使土壤排放的N2O減少；同時(shí)pH可以影響土壤中反硝化微生物的活性，進(jìn)而影響氮素平衡。但土壤偏堿性時(shí)，NO2－可以在土壤中暫時(shí)積累，當(dāng)土壤酸化嚴(yán)重時(shí)，NO2－直接參與反硝化過(guò)程最后生成N2O[60]。可見土壤pH也是影響農(nóng)田N2O排放的主要因素之一。1.2.3土壤微生物介導(dǎo)的N2O排放研究土壤氮循環(huán)主要包括4個(gè)過(guò)程，固氮作用、硝化作用、反硝化作用及氨化作用ADDINCNKISM.Ref.{08AD5B2DA3B744109D2C66D60561452E}[13]，其中氨氧化作用作為硝化作用的第一步,是硝化作用的限速環(huán)節(jié)，也是將銨態(tài)氮(NH4+-N)轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮(NO2--N)的主要途徑，主要由氨氧化古菌（Ammonia-oxidizingarchaea,AOA）和氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizingbacteria,AOB）共同完成ADDINCNKISM.Ref.{21FB466BAD1B491fA45B368250F824E0}[61-63]，其過(guò)程主要分為兩個(gè)部分，氨（NH3）在氧氣充足的情況下，被氨單加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)催化，最后生成NH2OH和H2O；NH2OH和H2O在羥胺氧化還原酶的作用下生成下NO2-，由于AMO只催化分子態(tài)的NH3，而土壤中的氨的形態(tài)主要為NH4+，導(dǎo)致土壤中NH3的濃度不斷降低，使得氨的氧化成為硝化過(guò)程的限速步驟，因此也受到越來(lái)越多的人的關(guān)注，并成為研究熱點(diǎn)之一。農(nóng)田土壤中排放的N2O主要來(lái)自于氨氧化微生物主導(dǎo)的硝化過(guò)程以及反硝化微生物作用的反硝化過(guò)程，其中氨氧化作用中的AOA只能通過(guò)中間產(chǎn)物NO和羥胺的非生物反應(yīng)產(chǎn)生N2O[64]，而AOB可以在硝化-反硝化耦合作用中產(chǎn)生N2O，也可以在羥胺氧化中產(chǎn)生的一氧化氮還原酶(Nor)的催化作用下產(chǎn)生N2O，因此，農(nóng)田土壤中氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)及豐度對(duì)會(huì)對(duì)土壤N2O的排放產(chǎn)生影響[65]。氮素含量和土壤理化性質(zhì)通過(guò)影響氨氧化微生物和反硝化微生物的豐度和群落結(jié)構(gòu)來(lái)影響土壤硝化作用和反硝化作用的強(qiáng)度[66-67]，從而影響土壤N2O的排放。在氮素含量較高的中性和堿性土壤中，AOB是硝化過(guò)程N(yùn)2O產(chǎn)生的主要驅(qū)動(dòng)者[68]，而在氮素含量較低的酸性土壤中，AOA是硝化過(guò)程N(yùn)2O產(chǎn)生的主要驅(qū)動(dòng)者[69]。當(dāng)土壤中的銨濃度較高時(shí)，此時(shí)氨氧化微生物主導(dǎo)的硝化作用釋放出大量的N2O[70]。反硝化作用是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤氮素?fù)p失的重要途徑，該過(guò)程中產(chǎn)生的N2O也是主要的溫室氣體。有研究者估計(jì)，全球70%的N2O排放來(lái)自土壤[71]。其中農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的排放量約占25%[72]。作為土壤氮素循環(huán)重要組成部分的反硝化作用是在硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、NO還原酶和N2O還原酶4種酶連續(xù)催化下將NO3還原為N2過(guò)程。由亞硝酸鹽還原為NO的過(guò)程是反硝化作用區(qū)別于其他硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng)，也是反硝化過(guò)程中最重要的限速步驟，亞硝酸鹽還原酶(Nir)是執(zhí)行該步驟的限速酶。因此，nir基因也成為反硝化細(xì)菌功能基因中研究最多的基因[73]。亞硝酸還原酶有兩種不同結(jié)構(gòu)形態(tài)，一種酶由含有銅基（Cu-nir）的nirK基因編碼，另一種由含有亞鐵血紅素cd1（cd1-nir）的nirS基因編碼[74]。很多研究將nirK和nirS基因作為環(huán)境樣品中反硝化微生物的分子標(biāo)識(shí)物。作物類型[75-77]、肥料類型及施用量[78-79]、土地利用方式[80-82]、溫度[83-84]、土壤含水量[83]、pH值[83-84]等因素的變化均可導(dǎo)致具有Nir酶的反硝化細(xì)菌群落變化，且在環(huán)境中nirK基因比nirS基因的分布更廣泛、對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)也更敏感[75]。1.3研究?jī)?nèi)容1.3.1黃土高原不同種植年限苜蓿草地溫室氣體排放特征采用靜態(tài)箱法結(jié)合氣相色譜儀，監(jiān)測(cè)不同種植年限苜蓿生育期和休閑期N2O排放動(dòng)態(tài)，明確不同種植年限苜蓿地N2O排放規(guī)律。1.3.2土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng)采用基于MiSeq平臺(tái)的高通量分子生物學(xué)測(cè)序技術(shù)，對(duì)氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）群落結(jié)構(gòu)、豐度、和多樣性進(jìn)行量化分析，揭示不同種植年限苜蓿土壤AOA、AOB群落的分布格局和主要影響因子。1.3.3苜蓿種植年限影響黃綿土N2O排放的機(jī)制借助回歸分析和冗余分析（RDA），分析探討N2O排放通量與其相關(guān)非生物因素和生物因素的偶聯(lián)關(guān)系，明確影響N2O排放的主控因子，解析黃土高原不同種植年限苜蓿地N2O排放的微生物學(xué)機(jī)制。1.4技術(shù)路線第二章．材料與方法2.1試驗(yàn)區(qū)概況本試驗(yàn)于2018年3-2019年10月在甘肅省定西市安定區(qū)李家堡鎮(zhèn)麻子川村甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站（104°44′E，35°28′N）進(jìn)行，該區(qū)屬于典型的黃土高原半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)，平均海拔2000m，年均太陽(yáng)輻射592.9kJ·cm2，平均日照時(shí)數(shù)2476.6h，年均氣溫6.4℃，>0℃的積溫2933.5℃，>10℃的積溫2239.1℃，無(wú)霜期1410d，年均降雨量400mm，年蒸發(fā)量1531mm，干燥度2.53。2018-2019年降雨量分布如圖1所示。圖1.試驗(yàn)地月降雨量分布Fig1.Distributionofmonthlyrainfallin2018-01~2019-12inDingxi(mm)2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理，分別為2003年(L2003)、2005年（L2005）、2012年（L2012）建植的紫花苜蓿，每個(gè)處理均為3次重復(fù)，各小區(qū)面積均為3×7=21m2，苜蓿品種為當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)品種隴東苜蓿，苜蓿建植當(dāng)年施純N105kg/ha，純P2O5105kg/ha，之后試驗(yàn)期間未施肥灌水，各處理田間管理保持一致，每年刈割兩次，分別為6月上旬和10月上旬。2.3測(cè)定指標(biāo)及方法2018年5月20日（苜蓿頭茬盛花期），分別采集不同種植年限苜蓿地中0-30cm和30-60cm土層土壤樣品，采用五點(diǎn)取樣法，各取樣點(diǎn)直線距離大于等于50cm，混合均勻后除去土樣中的石塊及作物殘茬，將土樣分為三份，一份在田間放入干冰箱帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃保存，用于土壤中氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)及豐度的測(cè)定；一份土樣放入4℃冰箱保存，使其保持生理活性，用于土壤中微生物量碳、微生物量氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮以及硝化潛勢(shì)的測(cè)定；剩余一部分土樣待風(fēng)干后帶回實(shí)驗(yàn)室用于土壤中全氮、有機(jī)碳、pH、脲酶、過(guò)氧化氫酶及硝酸還原酶的測(cè)定。2.3.1土壤N2O氣體的采集與測(cè)定從2018年3月至2019年10月，每半月采集一次，N2O用靜態(tài)箱法采集，采樣箱由1mm厚304K薄不銹鋼板制成，箱體直徑38cm，高35cm，底座內(nèi)徑36.5cm，埋入各小區(qū)中央，全年內(nèi)無(wú)移動(dòng)。箱體外覆反光鋁箔保溫膜，箱頂有一圓形塞口，用于插入溫度計(jì)，讀取箱內(nèi)溫度，箱內(nèi)側(cè)壁裝有一個(gè)寬為10cm的塑料制風(fēng)扇，用來(lái)混勻氣體，箱體側(cè)壁有一個(gè)采氣孔，并連接一根橡膠管用于注射器采樣。采樣時(shí)將采樣箱完全扣入底座凹槽并加水密封，箱頂圓形塞口插入溫度計(jì)并接通風(fēng)扇電源后用注射器分別采集100mL0min、10min、20min時(shí)的氣體樣品注入德霖鋁箔采樣袋中，密封保存，每次采樣結(jié)束后立即將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室分析。N2O使用安捷倫7890A型氣相色譜儀(7890AGCSystem，USA)進(jìn)行氣體樣品分析，色譜條件為色譜柱：PoraparkQ15m×0.53mm×25μm，進(jìn)樣口150℃，分流進(jìn)樣，檢測(cè)器為ECD，檢測(cè)溫度300℃，柱溫45℃，柱流速3.3ml·min-1，載氣為高純N2。2.3.2土壤理化性狀的測(cè)定土壤全氮采用凱氏定氮法ADDINCNKISM.Ref.{FE1FC5B1D3FF4d7eBB06021CCD4D9DA3}[85]；土壤有機(jī)碳采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱法ADDINCNKISM.Ref.{C3251DE8904647aaB5C28E863AF1FC05}[85]。硝、銨態(tài)氮采用2mol·L-1KCl浸提，半自動(dòng)化學(xué)間斷分析儀（SmartChemAST-6500S）測(cè)定ADDINCNKISM.Ref.{86633B0B5AB04ca99DED55FF37B1D0FA}[85]；土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸—硫酸鉀浸提，碳氮聯(lián)合分析儀測(cè)定ADDINCNKISM.Ref.{D7ECCA00B2024a2381EDD338CFA4FF30}[85]；土壤溫度采用曲管地溫計(jì)；土壤水分采用烘干法；土壤pH采用PB-10酸度計(jì)測(cè)定。2.3.3土壤酶活性的測(cè)定土壤脲酶采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法ADDINCNKISM.Ref.{4C6BE2F89B9E4cf3B68993B0EF67A9E5}[86]；土壤過(guò)氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法ADDINCNKISM.Ref.{A66DBEFE640D4d01A5EBF64E298D995D}[86]。土壤硝酸還原酶采用酚二磺酸比色法ADDINCNKISM.Ref.{0CC7633A3A6C4030A2C3213BA969618A}[86]。2.3.4土壤氨氧化微生物豐度及群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定DNA提?。和寥牢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)土壤總DNA采用PowerSoil?DNA提取試劑盒提取，所提取的DNA的純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳跑膠，用溴化乙錠染色之后在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。熒光定量PCR：DNA提取后，利用目標(biāo)基因引物Arch-amoAF/Arch-amoARADDINCNKISM.Ref.{431798A6C936492d94E87B615B924CFC}[87]和AmoA-1F/AmoA-2RADDINCNKISM.Ref.{104E14C0CF67434dB8CE3F0B332D255F}[88]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR采用TransGenAP221-02：TransStartFastpfuDNAPolymerase，PCR儀為ABI7500型熒光定量PCR儀。引物序列及反應(yīng)條件見表1。完成反應(yīng)條件的所有步驟后，把加好樣本的96孔板放在ABI7500型熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，以無(wú)菌水為空白陰性對(duì)照。將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行檢測(cè)定量。IlluminaMiseqPE300測(cè)序：對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并均一化混勻，利用聚合DNA產(chǎn)物構(gòu)建Miseq文庫(kù)，然后借助高通量測(cè)序平臺(tái)（IlluminaMiseqPE300）測(cè)序，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。表1目標(biāo)基因的引物名稱及引物序列Table1Primernamesandprimersequencesoftargetgenes2.4主要計(jì)算方法2.4.1溫室氣體排放通量的測(cè)定f=[(ρ2/t2-ρ1/t1)×H×M0×273]/（?t×22.4）上式中，f代指N2O氣體排放通量（mg·m-2·h-1）。H為采樣箱高度（m）；M0代指具體氣體分子量；?t為結(jié)束采樣時(shí)間與開始時(shí)間之差；t1、t2分別代指靜態(tài)箱關(guān)閉和開始過(guò)程對(duì)應(yīng)的箱內(nèi)溫度（K）；ρ1、ρ2分別代指靜態(tài)箱關(guān)閉時(shí)與開啟時(shí)的內(nèi)部的體積濃度（mol·mol-1）。2.4.2溫室氣體累積排放量M=Σ[(fi+1+fi)×0.5×(di+1-di)×24×0.01]式中，M為整個(gè)測(cè)定期內(nèi)溫室氣體（N2O）的累積排放量（kg·m-2）；f為溫室氣體（N2O）的排放通量（mg·m-2·h-1）；i=1、2…n為采樣系數(shù)；di+1-di為兩次采樣間隔天數(shù)。2.4.3增溫潛勢(shì)（GWP）累計(jì)增溫潛勢(shì)(GWP)GWP=M(N2O)×265[1]本研究以1kgCO2的增溫潛勢(shì)為1，1kgN2O的增溫潛勢(shì)分別為1kgCO2的265倍[3]。M(N2O)代表整個(gè)測(cè)定期內(nèi)N2O累計(jì)排放量（kg·m-2）。2.4.4多樣性指數(shù)計(jì)算方法Chao1：是用chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，chao1在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。本次分析使用計(jì)算公式如下：Schao1=Sobs+n其中Schao1=估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs=實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1=只含有一條序列的OTU數(shù)目（如"singletons"）；n2=只含有兩條序列的OTU數(shù)目（如"doubletons"）。Ace：用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao1的算法不同。本次分析使用計(jì)算公式如下：SACE=S其中，Nrate=i=1abundini；yyniSrateSabundabund=“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為10。Simpson：用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。D其中，SobsniN=所有的序列數(shù)。Shannon：用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一。它與Simpson多樣性指數(shù)類似，常用于反映群落alpha多樣性。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。H其中，SobsniN=所有的序列數(shù)。Coverage：是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。C=1-其中，n1N=抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。2.5數(shù)據(jù)處理使用Mothur指數(shù)分析，用于指數(shù)評(píng)估的OTU相似水平97%，得出土壤氨氧化微生物Alpha多樣性指數(shù)（Shannon和Sobs）、菌群豐富度指數(shù)（Chao1和ACE）。土壤理化性質(zhì)、AOA和AOBamoA基因拷貝數(shù)、微生物群落α多樣性指數(shù)均采用SPSS22.0和Excel數(shù)據(jù)處理軟件,差異顯著性分析利用單因素方差分析(ANOVA)、多重比較法(Duncan)和回歸分析。土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析采用Speraman相關(guān)分析法，N2O與氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性熱圖采用HEMI軟件分析，并用AI軟件修飾，冗余分析（RDA）采用上海美吉公司I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行處理，用AI軟件進(jìn)行修飾。第三章．結(jié)果與分析3.1黃土高原不同種植年限苜蓿地N2O排放特征3.1.1不同種植年限苜蓿土壤N2O排放的季節(jié)動(dòng)態(tài)圖3-1不同種植年限苜蓿土壤N2O排放通量Fig3-1N2Oemissionfluxinalafalfafieldwithdifferentgrowthyears測(cè)定期內(nèi)各處理N2O排放通量如圖3-1所示，各處理的變化趨勢(shì)基本一致，總體呈現(xiàn)出“夏秋季高，春冬季低”的季節(jié)變化規(guī)律。測(cè)定初期（2018年3月）此時(shí)苜蓿進(jìn)入返青期，土壤表現(xiàn)為N2O吸收態(tài)，排放通量約為-0.00817～-0.01908mg·m-2·h-1之后隨著土壤溫度回升，降水量增加，各處理均由N2O吸收態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镹2O排放態(tài)。并于2018年苜蓿第二茬再生期（7月15日）達(dá)到排放峰值，此時(shí)L2003處理N2O排放速率最高，為0.1679mg·m-2·h-1，其次為L(zhǎng)2005處理，為0.1514mg·m-2·h-1，L2012處理N2O排放速率最低，為0.1448mg·m-2·h-1。7月中旬開始N2O排放速率逐漸降低。苜蓿收獲后的休閑期，各處理N2O均由排放態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槲諔B(tài)，隨著土壤溫度濃度的降低，其吸收速率逐漸增加，并于2019年1月達(dá)到吸收峰值，此時(shí)L2012處理N2O吸收速率最大，為0.0413mg·m-2·h-1，其次為L(zhǎng)2005，約為0.0365mg·m-2·h-1，L2003處理的N2O吸收速率最小，為0.0323mg·m-2·h-1，此后各處理N2O吸收速率逐漸降低，并于2019年苜蓿頭茬返青期（3月底）由吸收態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榕欧艖B(tài)。在2019年4月-10月苜蓿整個(gè)生育期，各處理N2O排放趨勢(shì)與2018年基本一致。從苜蓿返青期開始，N2O排放通量逐漸增加，至苜蓿第二茬再生期達(dá)到峰值，之后隨著土壤溫度逐漸下降，降雨量減小，N2O排放通量開始逐漸降低。綜合2018年-2019年整個(gè)測(cè)定期來(lái)看，隨苜蓿種植時(shí)間的延長(zhǎng)，N2O排放速率增加。3.1.2N2O累積排放量和增溫潛勢(shì)不同種植年限苜蓿土壤N2O累積排放量和增溫潛勢(shì)如表3-1所示。N2O累積排放量隨著苜蓿種植年限延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，其中L2003處理累積排放量比L2005和L2012處理分別增加了4.47%和14.14%，差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。從增溫潛勢(shì)來(lái)看，N2O增溫潛勢(shì)隨苜蓿種植年限的延長(zhǎng)亦表現(xiàn)為增加的趨勢(shì)，且處理間差異顯著（P<0.05）。表3-1不同種植年限苜蓿土壤N2O累積排放量及增溫潛勢(shì)Table3-1N2OAccumulativeemissionsandwarmingpotentialinalafalfafieldwithdifferentgrowthyears3.2土壤理化性質(zhì)對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng)3.2.1土壤水分對(duì)苜蓿種植年限的響應(yīng)圖3-2不同種植年限苜蓿土壤含水量Fig.3-2Soilmoistureinalfalfafieldwithdifferentgrowthyears不同種植年限苜蓿地土壤含水量如圖3-2所示.各種植年限苜蓿地土壤水分從2018年苜蓿頭茬返青期（3月24日）開始各種植年限苜蓿土壤表層含水量逐漸下降，于2018年苜蓿頭茬盛花期（5月20日）降至最低值，此時(shí)含水量約為7.0%，從2018年苜蓿頭茬盛花期到頭茬收獲期（5月20日至6月20日），土壤含水量均保持在7.0%左右，基本趨于平穩(wěn)，從頭茬收獲期開始（6月20日）逐漸上升，于2018年二茬返青期（7月15日）達(dá)到第一個(gè)峰值，此時(shí)L2003處理土壤含水量最高，為18.3%，其次為L(zhǎng)2005處理，為18.0%，L2012處理土壤含水量最低，為17.1%，從2018年二茬再生期（7月15日）開始逐漸下降至7月下旬后又開始逐漸上升，并于8月中旬達(dá)到第二個(gè)峰值，此時(shí)L2003處理含水量最高，為19.6%，其次為L(zhǎng)2005處理，為19.1%，L2012處理土壤含水量最低，為17.8%，之后各處理含水量開始迅速下降，于2018年二茬盛花期（9月14日）達(dá)到谷底，之后各處理土壤水分稍有回升后又逐漸下降，于2018年二茬收獲后（10月30日）降至最低值，之后各處理土壤含水量又有所上升，此后由于進(jìn)入冬季，各處理土壤水分波動(dòng)不大。于2019年苜蓿頭茬返青期（3月26日）開始，各處理土壤含水量開始下降，在201