8 試驗3 漆酶產(chǎn)生菌的分開篩選

本文格式為Word版，下載可任意編輯——8試驗3漆酶產(chǎn)生菌的分開篩選試驗3漆酶產(chǎn)生菌的篩選

1.試驗原理：

菌種篩選包括分開、初篩和復(fù)篩等幾個步驟，挑揀具有某種能力的有用菌種，根據(jù)不同的篩選目的，采用不同的篩選路線。

白腐菌能夠分泌胞外氧化酶降解木質(zhì)素，被認為是最主要的木質(zhì)素降解微生物。木質(zhì)素降解酶系主要包括三部份:木質(zhì)素過氧化物酶(Lip）、錳過氧化物酶(MnP)以及漆酶(Lac)。由于漆酶能把分子氧直接還原為水，與其他木質(zhì)素降解酶相比，具有更大的實際應(yīng)用價值。漆酶是一種含銅多酚氧化酶，分子量在64-390kD之間。由于漆酶具有氧化與木質(zhì)素有關(guān)的酚類和非酚類化合物以及高度難降解環(huán)境污染物的能力,因此在食品工業(yè)、制漿和造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、土壤的生物修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此篩選高產(chǎn)漆酶的白腐菌顯得至關(guān)重要。

由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的繁雜性，可選用木質(zhì)素類典型化合物，如單聚物香草酸、愈創(chuàng)木酚、苯酚、磷甲基苯酚；二聚物愈創(chuàng)木基甘油-B-松柏醇醚(GGE）、脫氫聯(lián)松柏醇(DCA),1,2-二愈創(chuàng)木基丙烷-1,3-二醇等?？蛇x用相對低廉的愈創(chuàng)木酚為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基，從土壤中分開就可以篩選出產(chǎn)漆酶的木質(zhì)素降解菌。漆酶可以使無色的愈創(chuàng)木酚氧化為褐色，因此愈創(chuàng)木酚平板可以作為漆酶的篩選平板。

對于白腐菌來說，變色圈的形成有兩種：一種是變色圈在菌絲的外圈，此時菌絲圈直徑度色圈直徑小于1；另一種是變色圈，在菌絲的外圈形成菌絲圈直徑與變色圈直徑比值大于1的菌株。菌絲圈與變色圈直徑的比值可作為判斷該菌是否能選擇性降解木素的依據(jù)，比值小于1則該菌能選擇性降解木質(zhì)素；比值大于1的菌則首先降解纖維素。由于選擇性降解木質(zhì)素的菌株在制漿造造紙等行業(yè)更顯優(yōu)勢，因此本試驗主要是篩選選擇性降解木質(zhì)素的菌株。

本次試驗需6個課時，但試驗周期較長。

2.試驗材料

2.1儀器設(shè)備

電子天平、磁力攪拌器、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、純水機、移液槍等。2.2試劑

葡萄糖、KH2PO4、MgSO4?7H2O、VB1、愈創(chuàng)木酚、酒石酸鉀、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、Na2HPO4

瓊脂等。另外需要未生芽的馬鈴薯。2.3器皿工具

打孔器、游標卡尺、培養(yǎng)皿(洗凈烘干)、150mL三角瓶、250mL三角瓶、配套封口膜(配棉繩或橡皮筋)或硅膠塞若干、報紙一疊、15mL試管及配套硅膠塞(或試管帽、棉塞等)、玻棒、標簽紙、記號筆(藍、黑)、1000mL燒杯、50mL量筒、藥匙、衛(wèi)生紙、稱量紙等。2.4培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1L，葡萄糖20g，KH2PO43.0g，MgSO4?7H2O1.5g，VB1微量(約1mg)，瓊脂15g，pH6.0。馬鈴薯提取液制法如下：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1L，煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1L。滅菌后倒平板即可，并做斜面。

選擇性培養(yǎng)基(g/L)：俞創(chuàng)木酚1.0，酒石酸鉀0.1，蛋白胨2.6，MgSO4·7H2O0.5，KH2PO41.0，Na2HPO40.2，瓊脂15g。滅菌后倒平板，即為漆酶產(chǎn)生菌篩選平板。

PDA-Bavendamm培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中參與蹂酸至終濃度為0.01/100mL。

1

3.試驗方法3.1試驗準備

試驗準備工作在試驗課前一天晚上進行。主要工作是整理試驗臺，進行器皿耗材準備。配制培養(yǎng)基，同時準備在150mL三角瓶中參與45mL水，同時參與適量玻璃珠。以上材料滅菌備用。

3.2取樣

在校園內(nèi)取富含有機質(zhì)的深層土樣。

3.3分開純化

將土樣放入裝有玻璃珠的三角瓶中，輕輕晃動三角瓶，用玻璃珠打碎土粒，靜置30min，獲得土壤浸提液。用接種環(huán)蘸取土壤浸提液，在篩選平板上連續(xù)劃線，28℃培養(yǎng)2-3d。每天觀測一次平板，至出現(xiàn)褐色菌斑為止，挑取菌絲，接種于斜面上28℃培養(yǎng)2d后保存于4℃冰箱中。3.4初篩

重新培養(yǎng)入選的菌株，每個菌株一個PDA平板，到覆蓋整個平板為止。用無菌打孔器打取直徑為0.3mm×0.3mm的菌塊，接種到選擇性培養(yǎng)基上，每個菌株做3個重復(fù)，在30℃條件下培養(yǎng)7d，觀測菌落周邊棕紅色變色圈的形成，挑揀變色圈在菌絲外圍形成的菌株，并測量記錄菌絲直徑(dl)、變色圈直徑(d2)以及計算兩者比值(dl/d2)。根據(jù)所產(chǎn)生變色圈的大小及變色程度,選出d1、d2比值較小且生活力較高的菌株并用保藏培養(yǎng)基留種。

3.5復(fù)篩

用打孔器打取經(jīng)初篩后的菌株直徑為0.3mm×0.3mm的菌塊接種于PDA-Bavendamm平板上，28℃條件下培養(yǎng)7d，每個菌株做3個重復(fù)，觀測變色圈的形成狀況并記錄顯色時間，如能產(chǎn)生棕褐色輪環(huán)則為陽性反應(yīng)(+)，反之則為陰性反應(yīng)(-)，每天測量變色圈的直徑，選擇顯色快、變色圈直徑大的菌株保存。

3.6酶活性測定

將篩選出的菌株采用PDA平板培養(yǎng),待長滿平板后,用無菌打孔器切取培養(yǎng)好的菌落,接入產(chǎn)酶液體PDA培養(yǎng)基中,每瓶接種3個菌片,25±1、120r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。每天取樣一次，經(jīng)8層紗布過濾，4℃、6000r/min離心10min，取上清液,用于酶活性測定。

測定方法：采用ABTS方法。總反應(yīng)體系3mL中含0.5mol/L2,2'-連-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)溶液0.2mL,0.1mol/L醋酸鈉緩沖液(pH4.5)2.7mL,酶液0.1mL啟動反應(yīng)。測定反應(yīng)前3min內(nèi)反應(yīng)液在420nm處的吸光值增加。以煮沸滅活15min酶液做對照,酶定義為每分鐘使1umol/LABTS轉(zhuǎn)化所需的酶量為一個活力單位(U)。

3.7菌株保存

取經(jīng)過初篩和復(fù)篩獲得的菌株，接種于PDA斜面28℃培養(yǎng)后保存于4℃冰箱中備用。

4.本卷須知

4.1