級五年制實驗課腹腔巨噬細胞的分離與免疫化學染色

2010級五年制本科生

免疫學實驗課王慧文小鼠腹腔巨噬細胞分離及免疫細胞化學染色原理：抗原抗體反應＋免疫標記技術應用：細胞的蛋白質抗原進行亞細胞水平的定位；觀察抗原分布；比較不同抗原的分布差異；設立對照后可檢測細胞表達蛋白質的相對量。檢測方法：示蹤物的熒光或酶的有色反應、放射性或高電子密度可在光鏡或電鏡下進行定性或定位觀察。實驗原理Primaryantibody(Ab1)AntigenspecificityEnzyme免疫細胞化學技術基本步驟細胞樣本的制備細胞樣本的固定免疫染色檢測細胞樣本固定的目的防止抗原丟失。提高細胞膜的通透性，使抗體進入細胞與抗原結合。盡量使抗原保持能與抗體結合的狀態(tài)。維持細胞正常結構。實驗目的檢測小鼠腹腔巨噬細胞表面細胞膜分子CD68的表達情況實驗材料器材名稱量試劑名稱量1ml5ml注射器各1支含10%FCS的培養(yǎng)液1瓶/室3%H2O2-甲醇液1瓶/室培養(yǎng)液1瓶/室剪刀、鑷子1套5%BSA1瓶/室滴管（配膠帽）1支/組PBS1瓶/室EP管2個抗CD68抗體1只/室載玻片2張HRP標記的二抗1只/室加樣器（1000/20ul）1把/室DAB顯色緩沖液1.5ml加樣器頭1盒/室加樣器（200ul）1把/組倒置顯微鏡1臺/室溫箱1臺/室酒精棉若干/室濕盒1臺/室四人一組小鼠1只/組小鼠脫頸處死，剪開表皮后腹腔注射2ml培養(yǎng)液，輕揉腹部后用滴管吸出1ml放入EP管中。每組兩張載玻片（每張載玻片上已粘有2張圓形蓋玻片，用于巨噬細胞貼壁），寫好組別后，一張寫CD68，一張寫PBS，用加樣器取腹腔液各50ul加在載玻片上，再加入BSA50ul，小心放在濕盒中，37℃溫箱孵育30min，PBS輕輕沖洗。滴加一滴3%H2O2-甲醇液室溫10min，PBS輕輕沖洗。一張載玻片加抗CD68抗體50ul，另一張加PBS50ul作對照，溫箱孵育60min，PBS沖洗。各加50ul二抗，37度溫箱避光孵育30min，PBS沖洗3次，每次2min。加入DAB顯色液各一滴，避光室溫顯色5min后顯微鏡下觀察。實驗步驟腹腔巨噬細胞染色細胞因子的檢測技術生物活性檢測免疫學檢測分子雜交PCR檢測生物活性檢測免疫學檢測分子雜交PCR檢測免疫印跡

(Westernblotting)Westernblotting

是一種在固相膜上如硝酸纖維素(NC)膜進行的抗原抗體反應。蛋白質經過電流作用后，可以從膠轉移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標記的二抗孵育，進行底物顯色。由于抗原抗體反應特異性好，親合力高，Westernblotting檢測的靈敏度較高。實驗步驟SDSProteinBlottingImmuno-DetectionWesternblotting示意圖

+-MSample+-濃縮膠分離膠SDS(聚丙烯酰胺凝膠電泳)MSample蛋白印跡(ProteinBlotting)GelMembraneMSample轉印安裝示意圖吸水紙5張吸水紙5張注意：膜和膠的位置不能放反，且膜略大于膠。膜膠硝酸纖維