支原體優(yōu)秀課件

第十八章支原體、

衣原體、立克次體

第一節(jié)支原體是一類缺乏細(xì)胞壁、形態(tài)上呈高度多形性，能通過(guò)除菌濾器，在無(wú)生命培養(yǎng)基中能生長(zhǎng)繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物。由于它們能形成有分支的長(zhǎng)絲，故稱之為支原體。

支原體科分支原體屬和脲原體屬兩個(gè)屬。對(duì)人致病的主要為肺炎支原體、人型支原體、生殖器支原體、穿通支原體和溶脲脲原體。除此之外，支原體還經(jīng)常污染細(xì)胞培養(yǎng)，給實(shí)驗(yàn)室病毒分離、單克隆抗體制備等工作帶來(lái)一定困難。一、肺炎支原體感染呈全球性分布，主要侵犯呼吸系統(tǒng),借滑行運(yùn)動(dòng)穿過(guò)粘膜上皮細(xì)胞纖毛屏障，主要粘附因子為一類對(duì)胰酶敏感的表面蛋白，稱Pl蛋白。微生物特性1．形態(tài)與結(jié)構(gòu)類似酒瓶狀，沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。G-易著色，Giemsa染色呈淡紫色。細(xì)胞膜中膽固醇含量多。所有肺炎2株共同具有P1蛋白，是主要特異性免疫原和血清學(xué)診斷的主要抗原。

2.抗原結(jié)構(gòu)來(lái)自細(xì)胞膜，胞膜外層蛋白質(zhì)是主要抗原，常用生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)(GIT)與代謝抑制試驗(yàn)(MIT)鑒定。GIT是將吸有型特異性抗血清的濾紙片置于接種有支原體的固體培養(yǎng)基上，經(jīng)孵育出現(xiàn)同型血清抑制該型支原體生長(zhǎng)現(xiàn)象。MIT是將支原體接種在含有抗血清培養(yǎng)基中，若抗體與支原體型一致，則抑制該支原體不能分解葡萄糖產(chǎn)酸。此兩種方法可將支原體分成若干血清型。3．培養(yǎng)特性以二分裂繁殖，繁殖較慢；生長(zhǎng)需要膽固醇；反復(fù)傳代后呈“荷包蛋”狀菌落，可迅速溶解哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞。4．生化反應(yīng)肺炎支原體可根據(jù)是否能利用葡萄糖、水解精氨酸和尿素來(lái)與其他支原體進(jìn)行鑒別。檢驗(yàn)程序

1.標(biāo)本采集肺炎支原體有粘附細(xì)胞作用，以咽拭子標(biāo)本為好，取材后宜立即接種。2.PCR法快速、敏感和特異，目前某些臨床實(shí)驗(yàn)室以特異性引物通過(guò)這一技術(shù)從患者痰中檢測(cè)肺炎支原體DNA。3.電子顯微鏡觀察無(wú)細(xì)胞壁，易與細(xì)菌鑒別。4.分離培養(yǎng)以牛心消化液為基礎(chǔ),加20％小牛血清及新鮮酵母浸液制成的液體或固體培養(yǎng)基。加入青霉素,可防止雜菌生長(zhǎng)。初次分離生長(zhǎng)緩慢，在含5％C02下培養(yǎng)，10天長(zhǎng)出油煎蛋狀菌落。能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，不能利用精氨酸與尿素，可還原美藍(lán)。分離培養(yǎng)陽(yáng)性率不高，對(duì)臨床診斷意義不大,但對(duì)流行病學(xué)調(diào)查有重要意義。5．抗體檢測(cè)(1)ELISA：此法敏感，特異性高，快速、經(jīng)濟(jì)，并可檢測(cè)IgM和IgG抗體，為目前診斷的可靠方法。檢測(cè)分子量190kDa的P1蛋白，3h可完成試驗(yàn)，特異性高，敏感性為104CFU／μl標(biāo)本。(3)間接血凝試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，敏感度略高于補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)，感染發(fā)病后7天出陽(yáng)性，10-30天達(dá)高峰，12-26周逐漸降低。本試驗(yàn)與補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)類似，主要測(cè)lgM抗體，與生殖道支原體之間存在交叉反應(yīng)。(4)冷凝集試驗(yàn)

是一種非特異性試驗(yàn)。其方法是將患者血清與O型Rh陰性紅細(xì)胞在4℃下作凝集試驗(yàn)。有33％—76％肺炎支原體感染者為陽(yáng)性(效價(jià)≥1：64)。效價(jià)越高或雙份血清呈4倍以上升高，肺炎支原體近期感染的可能性越大。二、解脲脲原體也稱溶脲脲原體，是1954年Shepard首先從非淋菌性尿道炎(NGU)患者的尿道分泌物中分離獲得，因其分解尿素的特性命名為解脲脲原體。在分類學(xué)上屬人支原體科脲原體屬。是人類泌尿生殖道最常見的寄生菌之一，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，它與多種疾病有關(guān)，故引起國(guó)內(nèi)外有關(guān)學(xué)者的廣泛重視。2.引起非淋菌性尿道炎(NGU)，上行感染，可引起前列腺炎或附睪炎；陰道炎和宮頸炎，并可導(dǎo)致流產(chǎn)。因?yàn)榕c人精子膜有共同抗原，對(duì)精子可造成免疫損傷而致不育。微生物特性

1．形態(tài)結(jié)構(gòu)在液體培養(yǎng)基中以球形為主，直徑約50-300nm，單個(gè)或呈雙排列，能通過(guò)微孔濾膜；G-但不易著色，姬姆薩染色呈紫藍(lán)色。無(wú)細(xì)胞壁，細(xì)胞膜由三層膜構(gòu)成。內(nèi)、外兩層由蛋白質(zhì)組成，中層為類脂質(zhì)，胞內(nèi)含核糖體和雙股DNA。DNA中Ｇ十C含量為26．9～29．8mol％。2．培養(yǎng)特性營(yíng)養(yǎng)要求較高，需要供給膽固醇和酵母，常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為牛心消化液。37℃生長(zhǎng)良好，22℃生長(zhǎng)差，42℃不生長(zhǎng)，最適pH為5．5-6．5。在含95％N2和5％C02氣體環(huán)境下培養(yǎng)2天形成很小菌落，呈“荷包蛋”樣，放大200倍才能觀察到，故稱T株。生長(zhǎng)除膽固醇外，尚需尿素，有脲酶能水解尿素產(chǎn)氨，不分解葡萄糖和精氨酸。4．抵抗力由于無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)滲透作用特別敏感，易被脂類溶媒、清潔劑、酒精、特異性抗體和補(bǔ)體溶解。對(duì)熱抵抗力差。在4℃存活約2周左右，—70℃中可存活2-3年。對(duì)青霉素等作用于細(xì)胞壁的抗生素不敏感，對(duì)影響胞漿蛋白合成的抗生素敏感：對(duì)強(qiáng)力霉素、紅霉素、交沙霉素、白霉素、螺旋霉素、氯霉素、麥迪霉素、鏈霉素、丁胺卡那霉素等敏感。微生物檢驗(yàn)

1．標(biāo)本采集用無(wú)菌瓶收集診斷為非淋菌性尿道炎患者中段尿，慢性前列腺炎按摩后的前列腺液，原因不明的不育癥患者的精液，陰道炎與宮頸炎患者的炎性分泌物，羊水和血液等。尿標(biāo)本以無(wú)菌方法取10ml，離心沉渣作接種物。

2．標(biāo)本直接檢查

(1)核酸檢測(cè)16個(gè)血清型均有460bp的DNA片段。通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物的核酸雜交和序列分析，可將各種支原體鑒別分類。鑒于本法敏感性高、穩(wěn)定可靠、快速簡(jiǎn)便，將成為臨床快速診斷的重要實(shí)驗(yàn)手段。DNA探針技術(shù)法敏感，可測(cè)出50～100pg的DNA。3．分離與鑒定取標(biāo)本O．1～0．2ml接種于pH6．0含有酚紅和尿素的液體培養(yǎng)37℃孵育，顏色由黃變紅者為陽(yáng)性。陽(yáng)性者轉(zhuǎn)種于固體培養(yǎng)基上，瓊脂培養(yǎng)基中有尿素、0．05molHEPES緩沖液和MgS04，菌落呈黑褐色易辨認(rèn)，95％N2～5％C02或微厭氧環(huán)境中作次代培養(yǎng)，以低倍鏡觀察菌落形態(tài)。經(jīng)形態(tài)和生化反應(yīng)等檢測(cè)可作出初步鑒定。只分解尿素，不分解葡萄糖和精氨酸。用特異抗血清作MIT和GIT作進(jìn)一步鑒定。微生物檢驗(yàn)

1．標(biāo)本采集取材對(duì)象是AIDS患者或HIV感染者。用咽拭子。2．選SP-4培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，37℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察顏色有無(wú)變化，若由紅變黃透明無(wú)沉淀，視“培養(yǎng)可疑陽(yáng)性”，再用濾膜過(guò)濾。濾液轉(zhuǎn)種傳代，當(dāng)培養(yǎng)基顏色再度由紅變黃，則認(rèn)為“初代培養(yǎng)陽(yáng)性”。3.鑒定

生化反應(yīng)(1)培養(yǎng)物接種于含1％葡萄糖的SP-4培養(yǎng)基(發(fā)酵葡萄糖試驗(yàn))，若能分解它，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。(2)培養(yǎng)物接種于含有精氨殿(不含葡萄糖)的SP-4培養(yǎng)基(水解精氨酸試驗(yàn))中，若能水解它，pH上升。(3)培養(yǎng)物接種于僅含尿素的SP-4培養(yǎng)基(分解尿素試驗(yàn))中，觀察pH變化。代謝抑制試驗(yàn)(MIT)取104CFU／ml陽(yáng)性培養(yǎng)物分別加入2支含3ml改良的SP-4培養(yǎng)基中，其中1支加入適量抗Mpe標(biāo)準(zhǔn)血清作為試驗(yàn)管，另1支不加抗血清作為對(duì)照管，37℃培養(yǎng)。試驗(yàn)管顏色不變(生長(zhǎng)被抑制)，對(duì)照管顏色由紅變黃(支原體生長(zhǎng))。生長(zhǎng)被杭血清抑制的管為MIT陽(yáng)性，該培養(yǎng)物則為Mpe，根據(jù)抗血清的型別進(jìn)行Mpe分型。PCR

用Mpe套式PCR(nPCR)，靶基因?yàn)镸pe的16SrRNA基因特異性片段。Mpe-nPCR最終擴(kuò)增長(zhǎng)度為410bp，按試劑盒說(shuō)明書操作，能擴(kuò)增出特異性MpeDNA，認(rèn)為此法更靈敏、特異、快速的Mpe檢測(cè)方法?？贵w檢測(cè)國(guó)外學(xué)者在HIV感染者中用ELISA法檢測(cè)出大量Mpe抗體，其中無(wú)癥狀者的陽(yáng)性率為20％，有艾滋病者為40％，陰性對(duì)照0.3％。第二節(jié)衣原體

是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生、有獨(dú)特發(fā)育周期、能通過(guò)細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞型微生物。歸屬于廣義的細(xì)菌范疇。衣原體科包括沙眼衣原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體和家畜衣原體等四種。一、沙眼衣原體不僅可致眼部感染，而且可引起生殖泌尿系統(tǒng)感染、性病淋巴肉芽腫以及其他器官疾病。近年沙眼衣原體的感染率和危害性已超過(guò)淋球菌而居性傳播疾病之首，因而日益受到醫(yī)學(xué)界的重視。沙眼衣原體有沙眼生物變種、性病淋巴肉芽腫生物變種（LGV）和鼠生物變種等3個(gè)生物變種。1．沙眼亞種(1)沙眼：通過(guò)眼-手-眼途徑直接或間接密切接觸傳播。由A、B、Ba和C血清型引起。結(jié)膜引起局部炎癥。有濾泡增生。后期出現(xiàn)瘢痕及角膜血管翳，影響視力。(2)包涵體結(jié)膜炎：由B、Ba、D、Da等血清型引起。嬰兒通過(guò)產(chǎn)道感染，引起濾泡性結(jié)膜炎，不出現(xiàn)角膜血管翳。(3)泌尿生殖道感染：由D-K血清型引起。在性接觸傳播引起的非淋菌性泌尿生殖道感染（50％—60％）。易發(fā)展為持續(xù)感染或無(wú)癥狀攜帶者。2.性病淋巴肉芽腫亞種，由L血清型引起性病淋巴肉芽腫。侵犯腹股溝淋巴結(jié)，引起化膿性淋巴結(jié)炎和慢性淋巴肉芽腫。3.鼠生物變種為鼠間傳播，不侵犯人，與鼠肺炎有關(guān)。微生物特性1．發(fā)育周期與形態(tài)染色衣原體具有特殊的發(fā)育周期。①原體是細(xì)胞外存在形式，卵圓形，有胞壁和擬核,是發(fā)育成熟的衣原體，具有高度感染性，能吸附于易感細(xì)胞特異受體，增大形成網(wǎng)狀體；②網(wǎng)狀體或稱始體，圓形，二分裂增殖為繁殖型，無(wú)感染性。于感染24h后濃縮形成原體，最后細(xì)胞破裂釋放原體，再感染其他細(xì)胞，每個(gè)發(fā)育周期約需48—72h?？乖Y(jié)構(gòu)復(fù)雜，有屬、種、型等特異性抗原。(1)屬特異性抗原：為胞壁LPS，屬特異性補(bǔ)體結(jié)合抗原，應(yīng)用于血清學(xué)診斷。(2)種特異性抗原：位于主要外膜蛋白（MOMP）上，可用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和中和試驗(yàn)檢測(cè)。(3)型特異性抗原：也位于MOMP上，用單克隆抗體作微量免疫熒光試驗(yàn)?zāi)茏R(shí)別沙眼體的18個(gè)型別。培養(yǎng)特性沙眼衣原體專性活細(xì)胞內(nèi)寄生，用6—8d齡雞胚卵黃囊及各種傳代細(xì)肋培養(yǎng)。一般培養(yǎng)48—72h后可在細(xì)胞內(nèi)查到包涵體及原體和始體顆粒。近年多采用細(xì)胞培養(yǎng)衣原體，常用的細(xì)胞株為Hela-299和McCoy。抵抗力沙眼衣原體感染材料在37℃條件下，經(jīng)48h左右即失去活力，56℃6min滅活。-70℃可保存數(shù)年，冷凍干燥可保存30年以上仍有活性。O.1％甲醛或O.5％石炭酸溶液24h殺死沙眼衣原體，2％來(lái)蘇僅需5min。紅霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素或青霉素對(duì)衣原體有抑制作用。

沙眼和包涵體結(jié)膜炎病人，用拭子在結(jié)膜上穹窿涂擦或取結(jié)膜刮片。性病淋巴肉芽腫：采淋巴結(jié)膿汁，也可取直腸拭子或活檢材料送檢。用光學(xué)顯微鏡觀察包涵體有診斷意義，特別在眼結(jié)膜、尿道及子宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)典型包涵體更有沙眼衣原體感染的參考。免疫學(xué)方法1)免疫熒光檢查：用熒光抗體檢測(cè)上皮細(xì)胞內(nèi)衣原體抗原。標(biāo)記抗衣原體LPS抗體，可與所有衣原體反應(yīng)；而抗MOMP抗體有種、型特異性?？稍?h內(nèi)即作出診斷并可分型。2)酶免疫檢測(cè)：能在數(shù)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)出衣原體可溶性抗原，并適用于同時(shí)檢測(cè)大量標(biāo)本。核酸檢測(cè)1)核酸雜交：用125I標(biāo)記的衣原體rDNA探針檢測(cè)宮頸標(biāo)本的敏感性和特異性，與培養(yǎng)相比分別為82.8％和99.4％。2)PCR：具有高度敏感性和特異性。一般按沙眼衣原體7．5kb質(zhì)粒、MOMP序列及16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)引物。分離培養(yǎng)將標(biāo)本拭子，用含抗生素的稀釋液制成10％-20％懸液。分離的細(xì)胞有McCoy、HeLa-229細(xì)胞等。置5％CO2下培養(yǎng)。初代分離培養(yǎng)72-96h后傳代或盲傳。有癥狀病人90％標(biāo)本第1代即可見包涵體，而無(wú)癥狀病人需傳代后才得到陽(yáng)性。敏感性為80％-90％，特異性100％，是目前確診最可靠的方法，而且是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室診斷法的標(biāo)準(zhǔn)。雞胚培養(yǎng)有細(xì)菌污染的臨床標(biāo)本加適當(dāng)?shù)目股?如鏈霉素、慶大霉素和制霉菌素等)肉湯，在室溫中作用lh后，接種3-4只孵育7天的雞胚卵黃囊，35℃孵育，觀察至13天，收獲卵黃囊涂片，作Gimenez染色，鏡檢原體。鑒定1.將細(xì)胞培養(yǎng)蓋片用Giemsa或碘染色鏡檢胞質(zhì)內(nèi)包涵體。Giemsa染色比碘染色敏感，可作為鑒別沙眼衣原體的參考。2.可用型特異性熒光血清鑒定其型別。對(duì)于卵黃囊和小鼠分離的材料可用免疫熒光法鑒定原體或補(bǔ)體結(jié)合抗原?？贵w檢測(cè)目前檢測(cè)抗體的血清學(xué)方法在常規(guī)臨床診斷中價(jià)值很小。原因是不易獲得雙份血清，而且性傳播疾病的高危人群多有慢性重復(fù)感染，原有的抗體水平較高，因而限制了血清學(xué)方法的診斷價(jià)值。方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、微量免疫熒光試驗(yàn)(MIF)、酶免疫法等。其中CF敏感性和特異性較差，而MIF敏感性和特異性較高。三、鸚鵡熱衣原體鸚鵡熱衣原體是鸚鵡熱的病原體，主要引起禽畜感染，也可由動(dòng)物傳染到人，引起肺炎和毒血癥，亦有引起心內(nèi)膜炎的報(bào)道。也有衣原體獨(dú)特的生活周期，包涵體較致密，形態(tài)不一，碘染色陰性，是與沙眼衣原體鑒別要點(diǎn)(沙眼衣原體含糖原，碘染色陽(yáng)性)。抗原檢測(cè)1)免疫熒光檢查：以衣原體屬、種或型的單克隆抗體與熒光素結(jié)合后中衣原體抗原的存在，用微量免疫熒光法還可用于衣原體的分型。2)酶免疫法(EIA)檢測(cè)：將衣原體單克隆抗體與酶結(jié)合，用于組織或細(xì)胞的染色，槍測(cè)衣原體抗原。E1A法比免疫熒光法準(zhǔn)確性略高，且可避免主觀因素的影響。核酸檢測(cè)

1)核酸探針檢測(cè)法：將衣原體MOMP基因、特異LPS表位基因，及其他決定鸚鵡熱衣原體抗原的基因片段做成探針，對(duì)衣原體DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交或Southern印跡雜交試驗(yàn)，可準(zhǔn)確靈敏測(cè)出鸚鵡熱衣原體，也可用于種內(nèi)株系的鑒別。2)PCR：檢測(cè)3種衣原體的MOMP基因序列是簡(jiǎn)便、微量、快速、敏感的檢測(cè)力法。分離培養(yǎng)

(1)雞胚培養(yǎng)：鸚鵡熱衣原體的分離常用雞胚卵黃囊接種與傳代，可取得滿意效果。(2)小鼠分離：選擇腹腔接種、顱內(nèi)接種和滴鼻接種進(jìn)行試驗(yàn)。最具特征性的發(fā)現(xiàn)小鼠嗜眠和麻痹，脹氣的十二指腸上覆蓋一層薄的粘性滲出物，全肺葉有實(shí)變。(3)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)常用PL細(xì)胞、BHK細(xì)胞、Vero細(xì)胞等，鸚鵡熱衣原體均能生長(zhǎng)。但直接用于臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng)效果不好，最好先接種雞胚卵黃囊，經(jīng)繁殖后再細(xì)胞培養(yǎng)容易成功?？贵w檢測(cè)方法有補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CF)、間接血凝試驗(yàn)(IHA)和酶聯(lián)免疫吸附試(ELISA)等。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)：主要用于鸚鵡熱和性病淋巴肉芽腫以及肺炎的試驗(yàn)。CF抗體效價(jià)呈4倍增長(zhǎng)者可作診斷。一次CF抗體結(jié)果，需效價(jià)高于1：64才可能作臨床診斷。四、肺炎衣原體

肺炎衣原體是衣原體屬中的一個(gè)新種，只有一個(gè)血清型，是一種重要的呼吸道病原體。主要引起青少年急性呼吸道感染，可引起肺炎、支氣管炎、咽炎和鼻竇炎等。還可引起心包炎、心肌炎和心內(nèi)膜炎。肺炎衣原體性感染與急性心肌梗死和慢性冠心病的關(guān)系，越來(lái)越引起人們的注意。微生物特性

1．有衣原體獨(dú)特的生活周期，原體在電鏡下呈型的梨形，并有清晰的周漿間隙。2．全基因組測(cè)序已完成，與鸚鵡熱衣原體、沙眼衣原體的DNA同源性≤10％，而不同來(lái)擗TWAR株都具有94％以上的DNA同源性，其限制性內(nèi)切酶的圖譜相同。其單克隆抗體與沙眼衣原體及鸚鵡熱衣原體無(wú)交叉反應(yīng)。3．用HEp-2和HL細(xì)胞系較易分離和傳代?？贵w檢測(cè)以微量免疫熒光試驗(yàn)(MIF)最為敏感，該試驗(yàn)陽(yáng)性者50％～70％可分離出TWAR，用此法檢測(cè)特異性的IgM和IgG抗體，有利于區(qū)別近期感染和既往感染，也有利于區(qū)別原發(fā)感染和再感染，TWAR的再感染相當(dāng)常見，特別是老年人，再感染時(shí)一般不出現(xiàn)lgM和補(bǔ)體結(jié)合抗體。第三節(jié)立克次體

對(duì)人致病的立克次體有五個(gè)屬立克次體屬、柯克斯體屬、東方體屬、埃立克體屬和巴通體屬。

共同特點(diǎn)①大多是人畜共患病原體，引起人類發(fā)熱和出疹性疾病；②以節(jié)肢動(dòng)物為傳播媒介或?yàn)閮?chǔ)存宿主；③大小介于細(xì)菌與病毒之間，光鏡下呈多形態(tài)性，主要為微，桿狀或球桿狀，革蘭陰性；④除了少數(shù)外全是專性活細(xì)胞內(nèi)寄生；⑤菌體內(nèi)同時(shí)含有DNA和RNA兩類核酸；⑥以二分裂方式進(jìn)行繁殖；⑦對(duì)抗生素敏感。一、斑疹傷寒立克次體

(一)臨床意義

1．普氏立克次體是流行性斑疹傷寒(又稱虱傳斑疹傷寒)的病原體。病人是惟一的傳染源，體虱是主要傳播媒介，而非儲(chǔ)存宿主。傳播方式為虱-人-虱，體虱僅是傳染媒介。莫氏立克次體地方性斑疹傷寒(又稱鼠型斑疹傷寒)的病原體。嚙齒類動(dòng)物是主§宿主，傳播媒介是鼠蚤或鼠虱。鼠蚤叮咬人體時(shí)，常排糞于皮膚上，斑疹傷寒立克次體從抓破的傷口進(jìn)入人體。若有人虱寄生，可通過(guò)人虱為傳播媒介，繼發(fā)性地在人群中傳播。致病物質(zhì)有兩種，其一是內(nèi)毒素，主要成分為脂多糖(LPS)；其二為磷脂酶A,能損傷宿主細(xì)胞膜及溶解胞內(nèi)吞噬體膜，以利于病原體穿入宿主細(xì)胞并在其中生長(zhǎng)。普氏和莫氏立克次體所致的斑疹傷寒癥狀相似，以高熱、頭痛、全身皮疹為主要特征。伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等癥狀和實(shí)質(zhì)性器官損傷。(二)微生物特性1.比細(xì)菌小，呈多形態(tài)性，在感染細(xì)胞內(nèi)聚集成團(tuán),分布在胞質(zhì)內(nèi),Gimenez法染色后呈紅色，外表含有微莢膜結(jié)構(gòu)。2.必須在真核細(xì)胞內(nèi)才能生長(zhǎng)繁殖，培養(yǎng)時(shí)需要C02。通常采用5-9日齡雞胚作卵黃囊接種，于32℃-35℃孵育4～13d內(nèi)死亡，雞胚死亡時(shí)間與接種劑量大小呈直接相關(guān)。普氏和莫氏立克次體能在多種單層細(xì)胞上生長(zhǎng)繁殖。豚鼠可作立克次體的初代分離。3.有群特異性和種特異性兩種抗原。大部分立克次體與普通變形桿菌X菌株的菌體耐熱多糖抗原有共同的抗原性，故可用這些菌株代替立克次體抗原進(jìn)行凝集反應(yīng)去檢測(cè)抗體，這種交叉凝集試驗(yàn)被稱為外斐反應(yīng)，可供輔助診斷。

外斐反應(yīng)

立克次體病變形桿菌OX19變形桿菌OX2變形桿菌OXk流行性斑疹傷寒+++++-地方性斑疹傷寒+++++-斑點(diǎn)熱++++/++/++++-恙蟲病--++++腺熱--++(三)微生物檢驗(yàn)

1.標(biāo)本采集(1)病人血液標(biāo)本：發(fā)熱期均有立克次體血癥，在急性期較易檢出立克次體。爭(zhēng)取在用抗生素前采血，立即床側(cè)接種。(2)活檢或尸檢材料：肺、肝、脾、淋巴結(jié)、心瓣膜等標(biāo)本。2.標(biāo)本直接檢查

(1)免疫熒光檢測(cè)用于臟器檢查。制備標(biāo)本片薄而均勻，組織結(jié)構(gòu)清晰，固定后用熒光抗體染色,常見脾、肺及心瓣膜中有立克次體，也可在肝、腎及皮疹活檢組織中檢出。(2)核酸檢測(cè)PCR敏感性高，所需樣品量只需ELISA實(shí)驗(yàn)的1／5。以編碼17kD蛋白的基因和編碼普氏和莫氏立克次體169kD蛋白的基因作為擴(kuò)增靶區(qū)。引物R17-1、-2在65℃條件下能擴(kuò)增普氏和莫氏立克次體DNA。在瓊脂凝膠上產(chǎn)生一條340bp的核酸帶；引物R169-1、-2僅能擴(kuò)增普氏立克次體DNA，產(chǎn)生一條432bp的核酸帶。兩種引物同時(shí)使用，擴(kuò)增后普氏可產(chǎn)生340bp和432bp兩條帶，而莫氏只產(chǎn)生340bp一條帶。該法敏感性可達(dá)0．05ngDNA水平，重復(fù)性好，操作方便，對(duì)兩型立克次體早期、鑒別診斷以及自然生態(tài)宿主調(diào)查研究具有較大價(jià)值。3．分離培養(yǎng)(1)動(dòng)物接種選用健康雄性豚鼠接種以便觀察陰囊腫脹現(xiàn)象。每日測(cè)體溫，至40℃發(fā)熱時(shí)采血或臟器懸液、接種雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)以分離立克次體；感染莫氏立克次體豚鼠在發(fā)熱1—2日內(nèi)出現(xiàn)陰囊紅腫，解剖可見腹股溝淋巴結(jié)腫大、充血、脾大2-3倍，有腹水；有陰囊反應(yīng)者，睪丸有小出血點(diǎn)，鞘膜充血并有漿液性滲出物等。鞘膜涂片可查到立克次體。(2)鑒定用免疫熒光法鑒定感染動(dòng)物臟器、雞胚卵黃囊、細(xì)胞培養(yǎng)物中的特異性抗原以已知抗原測(cè)定動(dòng)物恢復(fù)期血清中的相應(yīng)抗體。必要時(shí)用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、微量凝集試驗(yàn)等，作群和種的鑒定。(3)分離株繁殖及保存①雞胚卵黃囊培養(yǎng)收獲卵黃囊，經(jīng)涂片染色鏡檢,含立克次體較多而又未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的卵黃囊膜，或?qū)⑵渥鞒蛇m當(dāng)濃度的懸液置-70℃冰箱保存，或冰凍干燥保藏；②細(xì)胞培養(yǎng)：選雞胚、成纖維、人羊膜、HeLa等細(xì)胞，接種培養(yǎng)、鑒定后將立克次體大量繁殖的感染細(xì)胞置-70℃儲(chǔ)存。4．抗體檢測(cè)立克次體病常用的血清學(xué)診斷方法除外斐反應(yīng)、間接免疫熒光(IFA)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)外，還有補(bǔ)體結(jié)合(CF)試驗(yàn)、微量凝集(MA)試驗(yàn)、間接血凝(IHA)試驗(yàn)、膠乳凝集(LA)試驗(yàn)等。(1)外斐反應(yīng)除Q熱、立克次體痘及羅沙利馬體感染為陰性外，其他為陽(yáng)性?；颊逴X凝集素上升較晚，在病程2周左右方出現(xiàn)陽(yáng)性，病程中雙份血清試驗(yàn)，若效價(jià)有4倍增長(zhǎng)，方有診斷意義。有些病例在病程中效價(jià)不見上升，約15％的經(jīng)疫苗接種后感染斑疹傷寒的病例。有些輕癥斑疹傷寒或某些發(fā)病嚴(yán)重者，其他血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性，但外斐反應(yīng)可為陰性。斑點(diǎn)熱病人外斐反應(yīng)效價(jià)通常為OX19高于OX2，但也有OX2較高者。若僅出現(xiàn)OX2陽(yáng)性，則對(duì)診斷斑點(diǎn)熱有特殊意義。(2)IFA試驗(yàn)為現(xiàn)在診斷立克次體病常用的方法。用已知立克次體抗原(感染雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)懸液)制片，以低稀釋度的病人血清初篩，有呈典型立克次體形態(tài)的明亮熒光顆粒者，判為陽(yáng)性。再將病程早期及晚期血清分別作雙倍或4倍稀釋以測(cè)效價(jià)，如呈4—8倍增長(zhǎng)者可明確診斷。(3)ELISA檢測(cè)IgM抗體對(duì)早期診斷有價(jià)值。立克次體抗原吸附于載體。泛影葡胺梯度離心純化抗原為優(yōu)，檢出血清的抗體效價(jià)高，紙上ELISA測(cè)定抗體，方法簡(jiǎn)便。將感染卵黃囊懸液加于玻片(經(jīng)氯仿·甲醇洗凈)上，涼干、固定，加稀釋血清于抗原點(diǎn)上，每張玻片上包括陽(yáng)性和陰性對(duì)照，加酶標(biāo)兔抗人IgM/G于抗原·血清點(diǎn)作用后，將浸透新鮮配制的底物無(wú)灰濾紙覆蓋在玻片上約4-6min，可見濾紙條上陽(yáng)性對(duì)照點(diǎn)位置顯紫棕色，取下濾紙條(即終止反應(yīng))，觀察是否顯色，與對(duì)照比較判定結(jié)果。此法簡(jiǎn)便，并可保存實(shí)驗(yàn)記錄。(4)CF試驗(yàn)

CF試驗(yàn)原來(lái)是立克次體病血清學(xué)診斷的經(jīng)典試驗(yàn)，雖然敏感性不如IFA和ELISA，但非常特異。一般在立克次體病發(fā)病一周內(nèi)，血清中即有CF抗體出現(xiàn)，以后逐漸上升，至第3周達(dá)最高峰，然后逐漸降至較低的效價(jià)，并可保持幾年不消失，但也有在病后幾周即轉(zhuǎn)陰性者。病人恢復(fù)期血清與斑疹傷寒群及斑點(diǎn)熱群立克次體可溶性抗原試驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果，只能說(shuō)明該群立克次體的感染。三、恙蟲病立克次體

又名東方立克次體是恙蟲病的病原體，由恙螨叮咬侵入人體，對(duì)人體致病性很強(qiáng)，釋放的毒素樣物質(zhì)是主要致病因素，引起發(fā)熱皮疹全身中毒癥狀，以及全身淋巴結(jié)腫大及各組織器官的血管炎病變。蟲咬處潰瘍形成黑色焦痂，周圍有紅暈等為其特征。為自然疫源性疾病。(一)微生物特性1．具有多形性，但以短桿狀為常見。G-,姬姆薩染色呈紫紅色,Gimenez染色呈暗紅色，背景為綠色?？梢澡b別恙蟲病立克次體和其他立克次體。分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，密集于細(xì)胞核旁。細(xì)胞內(nèi)寄生。2．培養(yǎng)特性(1)動(dòng)物接種：小鼠最敏感，刮取腹膜上的粘液涂片檢查，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量立克次體，尤以腹膜上皮細(xì)胞內(nèi)多見，常密集于細(xì)胞核旁。(2)細(xì)胞培養(yǎng)：恙蟲病立克次體可以在多種細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、繁殖，多采用Vero、L929細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞感染需要適宜的溫度和吸附時(shí)間，通常以37℃吸附1h，培養(yǎng)32℃為宜，繁殖緩慢，用Vero細(xì)胞培養(yǎng)8—9d，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，在細(xì)胞核旁高度密集，但不侵入細(xì)胞核。3．抗原成分恙蟲病立克次體具有耐熱性多糖抗原和特異性抗原。恙蟲病立克次體和變形桿菌OXk株有共同的抗原成分，在Weil-Felex反應(yīng)中，血清與OX，抗原發(fā)生凝集而不與OX19、OX2發(fā)生凝集。(二)微生物檢驗(yàn)

(1)抗原檢測(cè)：ELISA間接法是檢測(cè)標(biāo)本的特異性抗原或抗體的最常用方法。(2)PCR：可檢出20ng恙蟲病立克次體DNA；套式PCR法可檢出200pg，是目前最為快速、特異、敏感的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，可用于急性期患者的早期診斷。依據(jù)56KD蛋白抗原基因或58KD蛋白抗原基因序列選擇引物，進(jìn)行目的DNA擴(kuò)增，然后用1．5％瓊脂糖電泳法檢出特異性DNA帶。(3)分離培養(yǎng)接種小鼠分離病原。將標(biāo)本接種腹腔O．5ml，一般多在7～18天死亡，感染小鼠有明顯癥狀，瀕死前解剖，可見皮下淋巴結(jié)腫大充血，脾腫大，有粘稠的腹腔滲出液，以Giemsa染色鏡檢，在靠近細(xì)胞核旁邊可見成堆排列的立克次體。也可接種Vero細(xì)胞、L929細(xì)胞進(jìn)行立克次體分離培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)10—15天，取細(xì)胞涂片，Giemsa染色鏡檢。(4)抗體檢測(cè)外斐試驗(yàn)：臨床血清學(xué)診斷方法，血清抗體OXk效價(jià)達(dá)l：160以上有意義，病程中雙份或多份血清試驗(yàn)，若效價(jià)有4倍增高，有診斷意義。由于外斐試驗(yàn)特異性、敏感性低，容易造成誤診或漏診，不應(yīng)作為恙蟲病的診斷方法。免疫熒光試驗(yàn)：快速敏感特異，可分別檢測(cè)患者血清中的抗恙蟲病立克次體lgG、IgM抗體，效價(jià)在1：80以上有診斷意義。雙份血清有4倍或以上增長(zhǎng)可以確診。四、貝納柯克斯體

又稱Q熱立克次體，是引起Q熱(疑問(wèn)熱，指最初不明病因的發(fā)熱)的病原體。傳染源主要是受染的牛、羊等家畜，以蜱為傳播媒介，對(duì)人感染力特別強(qiáng)，通過(guò)接觸、呼吸道、消化道等途徑使人及動(dòng)物發(fā)生感染。Q熱除有發(fā)熱、頭痛及肌肉痛外，以出現(xiàn)肺炎和肝炎為其臨床特征。慢性Q熱主要表現(xiàn)為心內(nèi)膜炎。（一）微生物特性

1.形態(tài)與結(jié)構(gòu)個(gè)體較小，多為短桿狀，常排列成對(duì)，Gimenez法染色呈紅色，背景呈綠色，用Giemsa法染色呈紫紅色。有莢膜，在雞胚卵黃囊或細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)均可有芽胞形成。2.基因組與抗原成分基因組分子量為大腸桿菌的1／3；編碼代謝酶、表面抗原與毒力因子有關(guān)基因。有兩相抗原，Ⅰ相為光滑型LPS，Ⅱ相為粗糙型短鏈LPS。3．培養(yǎng)特點(diǎn)雞胚是培養(yǎng)的極好宿主。一般經(jīng)培養(yǎng)10—12d，1g卵黃囊膜?？色@得約1000μg純凈的立克次體能在多種人和動(dòng)物的原代或傳代細(xì)胞內(nèi)繁殖。一般不引起明顯的細(xì)胞病變。4．抵抗力貝納柯克斯體抵抗力強(qiáng)，70℃-90℃加熱30—60min尚難殺死。1%福爾馬林作用24小時(shí)也不能完全滅活。對(duì)氯霉素和四環(huán)素類抗生素敏感。(二)微生物檢驗(yàn)(1)標(biāo)本直接抗原檢測(cè)：免疫熒光法進(jìn)行檢測(cè)。(2)標(biāo)本直接核酸檢查：按16SrRNA非保守區(qū)序列合成寡核苷酸探針，能檢出5pgrRNA，如將非保守區(qū)特異性擴(kuò)增，其敏感性可達(dá)檢出1—10個(gè)貝納柯克斯體的水平。用貝納柯克斯休質(zhì)粒DNA片段制備的探針，不僅能快速檢出病原體，且能鑒別含QpHI或QpRS質(zhì)粒分離株，與呼吸道感染病原體DNA無(wú)交叉反應(yīng)。試驗(yàn)僅需8—12h即可得到結(jié)果。3．分離培養(yǎng)病原體分離只是在該地區(qū)尚未證明有Q熱存在，病情特別嚴(yán)重有必要。將標(biāo)本接種于豚鼠或培養(yǎng)細(xì)胞，觀察其發(fā)病與否或生長(zhǎng)情況，經(jīng)形態(tài)學(xué)、血清免疫學(xué)等鑒定后作出結(jié)論。4．抗體檢測(cè)

用間接免疫熒光試驗(yàn)、ELISA和CF試驗(yàn)。CF試驗(yàn)中抗原相的選擇對(duì)結(jié)果影響極大，對(duì)現(xiàn)癥診斷主要看Ⅱ相抗體逐漸上升，若Ⅰ相抗體保持較高水平，則往往說(shuō)明慢性感染或隱性感染。五、埃立克體(一)臨床意義為埃立克體病病原體。1.人腺熱埃立克體病可能由蜱傳播，也可能由于攝食生魚引起。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱頭痛、淋巴細(xì)胞數(shù)增加，并出現(xiàn)非典型淋巴細(xì)胞。。2.人單核細(xì)胞埃立克體(HME)病，主要侵染人的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。傳播媒介為蜱。3．人粒細(xì)胞埃立克體(HGE)病主要侵犯人粒細(xì)胞。硬蜱是傳播媒介。也是萊姆病病原體的攜帶和傳播者，故與萊姆病的相重疊。（二）微生物特性1．為G-小球菌，呈多形性，Romanows染色呈蘭色和紫色。吞噬細(xì)胞以內(nèi)吞的方式將埃立克體攝入胞內(nèi)，在胞質(zhì)內(nèi)以二分裂的方式繁殖，形成包涵體。稱為桑椹體。2．基因組埃立克體的16SrRNA基因極保守，但5’端的50—100堿基為高變區(qū)，適合設(shè)計(jì)PCR引物或核酸雜交探針。人粒細(xì)胞埃立克體的外膜蛋白44kDa蛋白被克隆，可用作探針。3．抗原成分在埃立克體屬內(nèi)的各種埃立克體均可有血清學(xué)交叉反應(yīng)。(三)微生物檢驗(yàn)1.標(biāo)本直接顯微鏡檢查采集病人的外周血制備血片，經(jīng)Giemsa或Wright染色，在光鏡下發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞及單核細(xì)胞質(zhì)或血小板內(nèi)有圓形、深紫色的桑椹體，可作為急性期埃立克體病的一種簡(jiǎn)便和有效的輔助診斷方法。2.核酸檢測(cè)

PCR是最有效的埃立克體病的病原學(xué)診斷方法，可用于埃立克體病的早期診斷。大約80％-87％HME和43％-75％的HGE患者的血標(biāo)本被PCR檢測(cè)為陽(yáng)性。特異性幾乎為100％，主要依賴引物的特異性?？捎?6SrRNA基因設(shè)計(jì)引物或做基因探針。有極高的敏感性，感染后數(shù)天就可檢出陽(yáng)性結(jié)果。3.細(xì)胞培養(yǎng)查菲埃立克體可用犬巨噬細(xì)胞系(DH82)，腺熱埃立克體用小鼠的巨噬細(xì)胞系(P388D1)，人粒細(xì)胞埃立克體則用人的粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系(HL-60)作它們的體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞。將3ml抗凝血的白細(xì)胞層，接種細(xì)胞單層，置37℃的5％C02孵育箱中培養(yǎng)，每隔3-4天換一次細(xì)胞維持液，并刮少許細(xì)胞涂片，用Giemsa染色，在光鏡下檢查埃立克體包涵體。4.小鼠接種