PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧課件

微生物基因工程李剛副教授教學(xué)內(nèi)容一、PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧；

二、基因組文庫的建立與篩選；

三、定向進(jìn)化技術(shù)在微生物酶制劑研究中的應(yīng)用；

四、原核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略；五、真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇和高效表達(dá)策略。一、PCR引物的設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)操作技巧聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、分子克隆及DNA序列分析這三大類實(shí)驗(yàn)方法幾乎構(gòu)成了現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。而三者中，PCR方法在理論上出現(xiàn)最早，在實(shí)踐中應(yīng)用得最廣泛。PCR引物設(shè)計(jì)的幾條原則：①引物長度一般引物長度為18-30堿基就足夠了。特殊情況下（比如Tm值或GC含量不合適）可以進(jìn)一步延長到50-60bp長度。但超過60bp的引物長度比較少見。原因一是超過60bp長度的引物比較難以合成，因此合成價(jià)格大幅度增加。另外長引物在合成的時(shí)候出錯(cuò)率也顯著增加。上下游引物的長度應(yīng)該基本相等，最好相差不要超過3bp。2.堿基組成G＋C含量應(yīng)在40％到60％之間，4種堿基要在引物中分配均勻。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。4．上下游引物的互補(bǔ)性一個(gè)引物的3‘端不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上。因?yàn)樵赑CR中引物的濃度往往是比較高，所以即使引物間微弱的互補(bǔ)，都會(huì)導(dǎo)致引物間形成雜交，隨后是引物二聚體的形成和擴(kuò)增。如果引物二聚體在PCR早期形成，它將和DNA聚合酶、引物及核苷酸競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)而抑制靶DNA的擴(kuò)增。精心進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，應(yīng)用熱啟動(dòng)PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶（如：AmpliGold，Perkin－Elmer）都可以避免引物二聚體的形成。當(dāng)在一個(gè)PCR中應(yīng)用多對(duì)引物時(shí)，請(qǐng)注意檢查任何一個(gè)3’末端都不能和其他任何引物互補(bǔ)。5.解鏈溫度（Tm）解鏈溫度（Tm）：也稱熔化溫度。計(jì)算出來的兩個(gè)引物的Tm值相差不能大于5C。擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值與引物的Tm值相差不能大于10C。這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每個(gè)PCR循環(huán)可有效地變性。為什么要計(jì)算引物的解鏈溫度因?yàn)镻CR的進(jìn)行需要確定三個(gè)溫度。第一，變性溫度，變性往往是在94C－95C進(jìn)行，這是TaqDNA聚合酶進(jìn)行30個(gè)或30個(gè)以上PCR循環(huán)而活力不致受到過多損失時(shí)所耐受的最高溫度；第二，退火溫度。也稱復(fù)性溫度。復(fù)性通常在比理論計(jì)算的引物和模板的溶解溫度（Tm值）低3－5C的條件下進(jìn)行。第三，延伸溫度。對(duì)TaqDNA聚合酶來說最適溫度一般為72C－78C。其中，變性溫度和延伸溫度對(duì)于每個(gè)PCR反應(yīng)來說幾乎都是固定的，唯一不同的就是退火溫度。而退火溫度與引物的解鏈溫度密切相關(guān)，因此必須計(jì)算出引物的解鏈溫度后才能確定PCR的退火溫度。6.3‘末端

3’末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。如果可能的話，每個(gè)引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C，不能為A。然而，并不推薦使用3’端有NNCG或NNGC序列的引物，因?yàn)槟┒薌C堿基高的自由能可以促進(jìn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，還可能產(chǎn)生引物二聚體。7．向引物的5‘端添加限制性酶切位點(diǎn)，噬菌體啟動(dòng)子等序列有用而又不與靶DNA序列互補(bǔ)的序列一般加到引物的5’末端。一般來說，這些序列的存在不會(huì)顯著地影響寡核苷酸和靶DNA之間的復(fù)性。這些附加序列包括噬菌體啟動(dòng)子和GC夾子。限制性酶切位點(diǎn)是一個(gè)特殊情況。因?yàn)槲挥贒NA分子5‘末端的限制性酶切位點(diǎn)的切割效率比較低，所以引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)至少3個(gè)核苷酸。保護(hù)堿基的確定保護(hù)堿基的確定不是隨意的，通常每一種限制性內(nèi)切酶都有自己最佳的保護(hù)堿基。每一種限制性內(nèi)切酶與其對(duì)應(yīng)的最佳保護(hù)堿基請(qǐng)到NEB公司網(wǎng)站或互聯(lián)網(wǎng)上查詢。PCR設(shè)計(jì)軟件推薦PrimerPremier5WDNASISOligo7

PCR高保真酶推薦PE公司（ABI）Parken－ElmerDNA聚合酶，TakaRa公司的PrimeSTARHSPolymerase，ToYoBo公司的Kod－PlusPolymerase。PCR產(chǎn)物的克隆

在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時(shí),所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。1.平末端連接：由于TaqDNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。2.在PCR產(chǎn)物克隆載體尾部加dT或ddT：TaqDNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對(duì)A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用TaqDNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前很多公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。3.粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后可定向克隆到載體中。模板最容易出現(xiàn)的問題一、模板含有雜質(zhì)：①模板中含有雜蛋白質(zhì)；②模板中含有Taq酶抑制劑；③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚；⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定,不宜隨意更改。

二、模板發(fā)生變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。通常模板發(fā)生變異的主要原因是模板切膠回收時(shí)間過長（一般應(yīng)控制在1分鐘以內(nèi)）或無意中將模板置于超凈工作臺(tái)中滅菌所致。

PCR引物常見的問題引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。④引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

DNA聚合酶的問題酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)PCR失敗是由于忘加了酶。

PCR反應(yīng)體積通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。如果不愿重新摸索條件，一個(gè)最簡(jiǎn)單可行的辦法是按照小體積的條件多做幾管，最后將PCR產(chǎn)物匯集在一起。

另外，PCR管有普通管和薄壁管（thinwallPCRtubes

）之分。普通管和薄壁管的熱傳導(dǎo)效率是不同的。熱蓋與非熱蓋PCR儀早期的PCR儀均為非熱蓋，因此每個(gè)PCR反應(yīng)管中需要加入無菌石蠟油，以防止溶液的蒸發(fā)?，F(xiàn)在的PCR儀大部分都有熱蓋（及頂部加熱器），會(huì)阻止溶液的蒸發(fā)，因此PCR反應(yīng)管中不需加入石蠟油了。非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策（一）其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物；減低酶量或調(diào)換另一來源的酶；降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)；適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(98℃變性，65℃左右退火與延伸.如TaKaRa公司的PrimeSTARHSDNAPolymerase就是采用的二溫度點(diǎn)法)。

非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策（二）采用熱啟動(dòng)PCR：把PCR混合物在顯著低于Tm值的溫度下作哪怕短暫的保溫，也可能產(chǎn)生引物二聚體和非特異性配對(duì)。熱啟動(dòng)PCR則可以大大減少這些麻煩。其目標(biāo)是在第一個(gè)循環(huán)中等溫度升到超過反應(yīng)物的Tm值后才允許反應(yīng)中的一兩種關(guān)鍵成分進(jìn)入反應(yīng)。例如在覆蓋有礦物油的小試驗(yàn)中，所有反應(yīng)管的一種公共成分（如Taq酶）可以先不加，而到第一個(gè)循環(huán)的變性階段溫度超過80℃以后再加。最近有一種熱啟動(dòng)的方法是在加入TaqDNA聚合酶前先在管中加入其單克隆抗體（Clonetech公司的TaqStartAntibody，或者ToYoBo公司的KodPlusDNA聚合酶），在溫度升高到將中和抗體變性失活之前，抗體阻遏聚合酶的活性，防止反應(yīng)開始。非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)的對(duì)策（三）嵌套式和半嵌套式PCR對(duì)于減少或消除不需要的產(chǎn)物同時(shí)提高靈敏度經(jīng)常是很成功的。首先在常規(guī)條件下用第一套跨越目的DNA片段的引物擴(kuò)增，假象產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)與引物中的一條或兩條配對(duì)，但其內(nèi)部卻是無關(guān)序列。接著對(duì)一部分反應(yīng)物－產(chǎn)物混合物進(jìn)行新一輪擴(kuò)增，采用的引物與第一對(duì)引物內(nèi)側(cè)的序列配對(duì)，在這一輪擴(kuò)增中只有真正的產(chǎn)物被擴(kuò)增。這種辦法即使在目的產(chǎn)物開始用EB染色檢測(cè)不到而且有假象帶時(shí)也常常獲得成功。半嵌套式PCR，只第二條引物在目的片段一端的內(nèi)側(cè)，也同樣有效。在基因步行或企圖進(jìn)行5‘或3’端RACE時(shí)，由于只有一條引物內(nèi)部的序列是已知的，經(jīng)常需要作這種變動(dòng)。采用嵌套式PCR方法，第一、二輪擴(kuò)增在第20個(gè)循環(huán)左右終止而不是象通常的在第30－35個(gè)循環(huán)終止會(huì)獲得更好的結(jié)果，這樣做減少了產(chǎn)生不需要的高分子量帶和成片產(chǎn)物的機(jī)會(huì)。嵌套式PCR極端敏感，在106基因組DNA背景中一個(gè)拷貝的病毒基因也能檢測(cè)到。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶；減少dNTP的濃度；適當(dāng)降低Mg2+濃度；增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

進(jìn)行多輪PCR時(shí)，PCR產(chǎn)物

成片的原因?進(jìn)行多輪PCR時(shí)，如果下一輪PCR反應(yīng)的起始模板量太大，即使PCR條件是正常的，產(chǎn)物成片現(xiàn)象也可能會(huì)出現(xiàn)?？偟囊?guī)則是如果上一輪PCR產(chǎn)物在凝膠上見得到條帶，只能用1l上一輪PCR產(chǎn)物的1：104到1：105稀釋物作為模板進(jìn)行下一輪PCR。另外對(duì)上一輪PCR產(chǎn)物稀釋也降低了下一輪PCR產(chǎn)物出錯(cuò)的概率。很少或沒有檢測(cè)到產(chǎn)物的原因如果已經(jīng)調(diào)整了Mg2＋濃度、緩沖液的pH值和循環(huán)產(chǎn)物，而且也增加了循環(huán)數(shù)，嘗試過了較低的退化溫度和TDPCR，但在EB染色的凝膠上還是看不到產(chǎn)物（聚丙烯酰胺凝膠比瓊脂糖凝膠要敏感一些），而陽性對(duì)照表明試劑沒有問題，下一步該怎么辦？延長起始的變性時(shí)間和（或）提高溫度能增加模板DNA完全變性的可能，以提供最大數(shù)量的引物配對(duì)位點(diǎn)。這一可選步驟的標(biāo)準(zhǔn)條件是95C變性5分鐘，有可能擴(kuò)增發(fā)生了，只是效率不高，如果這樣，可通過對(duì)干凝膠或印跡的雜交來檢測(cè)產(chǎn)物。用同一套引物或者最好用嵌套式引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增