GFP綠色熒光蛋白課件

綠色熒光蛋白

在抗腫瘤藥物研究中的應(yīng)用概述1962年Shimomure等首先從維多利亞水母(AequoreaVictoria)中分離出了GFP(Green-FluorescentProtein)。1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)。1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細(xì)胞和線蟲中表達(dá)了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河。之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細(xì)胞中表達(dá)，GFP在細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮。GFP的發(fā)光特性GFP吸收的光譜,最大峰值為395nm(紫外),并有一個峰值為470nm的副峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜最大峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,因此為熒光素FITC設(shè)計的熒光顯微鏡濾光片組合同樣適用于GFP觀察。盡管450～490nm(藍(lán)光)是GFP的副吸收峰,但由于長波能量低,細(xì)胞忍受能力強(qiáng),因此更適合于活體檢測。GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此更適用于定量測定與分析。但因為GFP不是酶,熒光信號沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白。由于GFP熒光是生物細(xì)胞的自主功能,熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報告蛋白,其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。ComparisonofGFPandLuciferaseImaging

MethodMinimumcellsimageableinvitroMinimumcellsimageableinvivoNeedforsubstrate?Needforanesthesia?MethodofvisualizationMulticolorimagingGFP11NoNoDirectImagingYesLuciferase3003000YesYesPhotoncounting(pseudo-color)NoGFP在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用GFP作為新型報告基因用于轉(zhuǎn)基因研究GFP融合蛋白用于研究蛋白質(zhì)定位、移動及相互作用研究活細(xì)胞分子變化過程發(fā)育分子機(jī)理研究示蹤病原菌臨床檢驗在腫瘤研究中的應(yīng)用GFP在腫瘤發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用GFP是一個分子量較小的蛋白,易與其他一些目的基因形成融合蛋白且不影響自身的目的基因產(chǎn)物的空間構(gòu)象和功能。GFP與目的基因融合,將目的基因標(biāo)記為綠色,即可定量分析目的基因的表達(dá)水平,顯示其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置和量的變化,為探討該基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用及其分子機(jī)制提供便利條件。在腫瘤的形成過程中,增殖和凋亡是一對相互矛盾的統(tǒng)一體。若腫瘤細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢,腫瘤組織將長期處于休眠狀態(tài)或自行消亡。腫瘤細(xì)胞的凋亡受凋亡相關(guān)基因調(diào)控。用GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因,并與正常組織進(jìn)行比較,若過表達(dá),則大致可判斷此基因為抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因;反之,為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因。腫瘤細(xì)胞浸潤是腫瘤細(xì)胞粘連、酶降解、移動和基質(zhì)內(nèi)增殖等一系列過程的表現(xiàn),其根本原因在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因表達(dá)異常。利用GFP的示蹤特性,研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些基因異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸潤的關(guān)系,即可揭示腫瘤細(xì)胞浸潤的某些機(jī)制。為了克服上述缺陷,Yang等建立了一種在活體內(nèi)可連續(xù)、重復(fù)、動態(tài)觀察腫瘤細(xì)胞生長及瘤體形成過程的方法。Externalwhole-bodyimagesoftheBxPC-3-GFPprimarytumorcomparedwithinternalimages.A,fluorescentimagesoftheprimarypancreatictumor(P),omental(O),bowel(B),andspleen(S)metastases.B,animageofthesamemouseafterlaparotomyinternallylocalizedtheexternalimagesofmetastatictumors.初步經(jīng)驗顯示,熒光的強(qiáng)弱與腫瘤大小、深度有關(guān),腫瘤位于皮下0.5mm時,可檢測到的最小瘤灶為59μm;距皮下2.2mm時,能夠檢測到的瘤體約為1.8mm;深在部位的腫瘤,其所發(fā)出的熒光由于受周圍組織,尤其是皮膚的干擾,小的瘤灶常難以顯示。為此,Yang等在欲檢測的器官做一個可逆性的皮瓣,觀察時打開皮瓣,建立一條熒光通路,大大提高了檢測的敏感性,從而可檢測出腦內(nèi)、肝內(nèi)單個腫瘤細(xì)胞,以及由數(shù)個腫瘤細(xì)胞形成的肺內(nèi)微小瘤灶。HumanU-87-RFPgliomagrowinginbrainofnudemouse.Whole-bodyimage.Braincancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationGreenFluorescentProteinexpressionRedFluorescentProteinexpressionOrthotopictransplantationofintacttissue

Metastaticsites

lymphnodes

liver

lung

skeleton

Estrogen-dependent

Estrogen-independent

GreenFluorescentProteinexpression

RedFluorescentProteinexpressionMX-1-GFPand–RFPbreastcarcinomagrowingonmammaryfatpadsofSCIDmouse.Whole-bodyimage.Breastcancermodels

FeaturesHumanLOX-1-GFPmelanomametastasizedtolung(A),lympnode(B),bone(C)andadrenalgland(D)ofnudemouse.Melanomamodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

lung

skeleton

brain

kidney

adrenalglandsPC-3humancarcinomagrowingonprostateandmetastasizedtonumerouslymphnodesofnudemouse.Whole-bodyimage.Prostatecancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

liver

lung

skeletonGreenFluorescentProteinexpressionRedFluorescentProteinexpressionNUGC-4-GFPhumanstomachtumorinnudemouse.Primarytumor-redarrow,lymphnodemetastases-whitearrowsStomachcancermodels

FeaturesOrthotopictransplantationofintacttissueMetastaticsites

lymphnodes

liver

lung

pancreas

adrenalgland

kidney

peritoneumGreenFluorescentProteinexpressionGFP在抗腫瘤藥物篩