核酸化學(xué)3課件

第四節(jié)核酸的理化性質(zhì)一、性狀和溶解度1.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，均微溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。2.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。3.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對(duì)堿穩(wěn)定。核酸分子中既含有酸性基團(tuán)（磷酸基）也含有堿性基團(tuán)（氨基），具有兩性性質(zhì)。由于核酸分子中的磷酸是一個(gè)中等強(qiáng)度的酸，而堿性（氨基）是一個(gè)弱堿，所以核酸的等電點(diǎn)比較低。如DNA的等電點(diǎn)為4～4.5，RNA的等電點(diǎn)為2～2.5。RNA的等電點(diǎn)比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通過(guò)氫鍵促進(jìn)了磷酸基上質(zhì)子的解離。DNA沒(méi)有這種作用。二．核酸的兩性性質(zhì)及等電點(diǎn)1.DNA或RNA的定量OD260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）20μg/ml寡核苷酸2.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0OD260的應(yīng)用四、核酸的變性、復(fù)性、分子雜交1、核酸的變性(denaturation)指核酸雙螺旋區(qū)的多聚核苷酸鏈間的氫鍵斷裂，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過(guò)程。核酸的變性不涉及磷酸二酯鍵的斷裂；一級(jí)結(jié)構(gòu)(堿基順序)保持不變。變性的因素：①高溫，②強(qiáng)酸強(qiáng)堿，③有機(jī)溶劑，④射線等DNA的變性(denaturation)方法：過(guò)量酸，堿，加熱，變性試劑如尿素、酰胺以及某些有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等。變性后其它理化性質(zhì)變化：①紫外吸收增加（增色效應(yīng)）：②沉降速率增高；③粘度降低；④生物功能減少或喪失。DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂增色效應(yīng)：（hyperochromiceffect）：DNA變性后，在260nm處的紫外吸收增高，稱為高色效應(yīng)或增色效應(yīng)。

。當(dāng)DNA的稀鹽溶液加熱到80-100℃時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)即發(fā)生解體，兩條鏈彼此分開(kāi)，形成無(wú)規(guī)線團(tuán)。8090100100%50%OD260（254）

Tm變性溫度范圍①②③℃熔點(diǎn)溫度（meltingtemperature,Tm）：DNA熱變性過(guò)程中，使其對(duì)260nm紫外光的吸收度突然增加，紫外吸收達(dá)到最大值的一半時(shí)溶液的溫度稱為熔點(diǎn)溫度（Tm）或解鏈溫度、變性溫度。實(shí)驗(yàn)室常用的方法——熱變性一般DNA的Tm值在70-85C之間。DNA的Tm值與分子中的G和C的含量有關(guān)。G和C的含量高，Tm值高。因而測(cè)定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量。（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm=69.3＋0.41(G+C)

%將熱變性后的DNA溶液緩慢冷卻，在低于變性溫度約25～30℃的條件下保溫一段時(shí)間（退火），則變性的兩條單鏈DNA可以重新互補(bǔ)而形成原來(lái)的雙螺旋結(jié)構(gòu)并恢復(fù)原有的性質(zhì)。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過(guò)程稱為退火(annealing)。在適當(dāng)條件下（退火），變性DNA的兩條互補(bǔ)鏈可恢復(fù)天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。2、核酸的復(fù)性（renaturation)一系列性質(zhì)將得到恢復(fù)，但是生物活性一般只能得到部分的恢復(fù)。DNA復(fù)性主要受三種因素的制約：1)將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時(shí)，DNA不可能復(fù)性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時(shí)（比Tm低25℃左右最佳），可以復(fù)性。2）DNA濃度較高時(shí)，兩條互補(bǔ)鏈彼此相碰的機(jī)會(huì)增加，易于復(fù)性。重復(fù)片段越多，復(fù)性越快。3）DNA片段的大小：DNA片段越大，復(fù)性越慢DNA復(fù)性3、核酸的雜交熱變性的DNA單鏈，在復(fù)性時(shí)可與同源DNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。兩條來(lái)源不同的單鏈核酸（DNA或RNA），只要它們有大致相同的互補(bǔ)堿基順序，經(jīng)退火處理即可復(fù)性，形成新的雜種雙螺旋，即核酸的分子雜交。DNA-DNA雜交；DNA-RNA雜交。不同來(lái)源的，具有大致相同互補(bǔ)堿基順序的核酸片段稱為同源序列。核酸的雜交核酸探針（nucleicacidprobe）:能特異性的探測(cè)帶某一特定序列的DNA或RNA分子的標(biāo)記核酸分子。Southernblotting(印跡）將待檢測(cè)的DNA分子用限制性內(nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。

用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),

如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

Northernblotting原理：在變性條件下將待檢的RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，繼而按照同SouthernBlot相同的原理進(jìn)行轉(zhuǎn)膜和用探針進(jìn)行雜交檢測(cè)。用途：檢測(cè)樣品中是否含有基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）及其含量。

4、沉降核酸與蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)各有不同的沉降系數(shù)，在超離心機(jī)的強(qiáng)大引力場(chǎng)中，它們的沉降速率差異很大。超離心法可以使核酸與其他雜質(zhì)分開(kāi)；也可使不同類型的核酸分開(kāi)。5、核酸的水解（1）酸或堿水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸或堿性條件下水解切斷。DNA和RNA對(duì)酸或堿的耐受程度有很大差別。在0.1mol/LNaOH中，RNA幾乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同樣條件下則不受影響。這種水解性能上的差別，與RNA核糖基上2′-OH的鄰基參與作用有很大的關(guān)系。在RNA水解時(shí)，2′-OH首先進(jìn)攻磷酸基，在斷開(kāi)磷酯鍵的同時(shí)形成環(huán)狀磷酸二酯，再在堿的作用形成水解產(chǎn)物。2）、酶水解凡是能水解核酸的酶都稱為核酸酶。從多核苷酸鏈的末端開(kāi)始水解核酸的酶稱為核酸外切酶；從多核苷酸鏈中間開(kāi)始水解核酸的酶稱為核酸內(nèi)切酶。能識(shí)別特定的核苷酸順序，并從特定位點(diǎn)水解核酸的內(nèi)切酶稱為限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）（restrictionnuclease）。以DNA為底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA為底物的RNA水解酶（RNases）。五、核酸的分離純化、測(cè)定及研究方法（一）分離核酸的一般原則因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子的污染。1、核酸的分離和純化時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：2、核酸的純度要求①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。3、核酸分離純化的注意事項(xiàng)為保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：①盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進(jìn)行；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要金屬二價(jià)陽(yáng)離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過(guò)程中的主要危害因素；④減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。二、核酸分離純化的一般步驟破碎細(xì)胞→去除蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)→純化干燥→溶解

核酸提取方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點(diǎn)而定。對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，采用先提取細(xì)胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。三、核酸的測(cè)定方法1、紫外吸收法2、定糖法3、定磷法四、核酸序列測(cè)定

DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定方法1.Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測(cè)序）

DNA的合成總是從5′端向3′端進(jìn)行的。DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引物鏈。DNA的合成過(guò)程中，在合成的DNA鏈的3′末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過(guò)生成新的3′,5′－磷酸二酯鍵，使DNA鏈合成終止，產(chǎn)生短的DNA鏈。

具體測(cè)序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長(zhǎng)度的、不同長(zhǎng)短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過(guò)聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長(zhǎng)短分離開(kāi)，經(jīng)過(guò)放射自顯影顯示區(qū)帶，就