畢赤酵母常用培養(yǎng)基與載體

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一、畢赤酵母表達常用載體：

典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標(biāo)記及3'AOX1區(qū)。當(dāng)整合型載體轉(zhuǎn)化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號序列。而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α交配因子(α-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZαA，pYAM75P等。胞內(nèi)表達載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115（AOX1），KM71，SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標(biāo)記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位點彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達菌株的獲得方式：與自主復(fù)制的質(zhì)粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。表達蛋白純化方法：酵母系統(tǒng)表達的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫柔的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。

二．畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制和用途

2.1LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基：

Tryptonl％

YeastExtract0.5％NaCll％PH7.0

制作平板時參與2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時可參與Zeocin25ug/ml。

2.2LLB（LowSaltLB）培養(yǎng)基：

Tryptonl％

YeastExtract0.5％

NaCl0.5％PH7.0

制作平板時參與2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時，參與Zeocin25ug/ml，可以4℃條件下保存1～2周.

2.3YPD（又稱YEPD）

YeastExtractPeptoneDextroseMedium，（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基）

Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100μg/ml

液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存,是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂YPD平板在4℃可保存幾個月。參與Zeocin100ug/ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4℃條件下保存1～2周。

2.4BMGY培養(yǎng)基

Yeastextract1%Peptone2%磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%Glycerol1%

畢赤酵母誘導(dǎo)表達前培養(yǎng)基，YNB和Biotin過濾除菌。培養(yǎng)24小時后，一般靜置過夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養(yǎng)基，改換BMMY培養(yǎng)基，進入誘導(dǎo)表達階段。

2.5BMMY培養(yǎng)基

Yeastextract1%Peptone2%磷酸鉀緩沖液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%methanol3%

畢赤酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基，YNB和Biotion過濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時每24小時之后參與3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時。

2.6YPDS+Zeocin培養(yǎng)基（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）：

yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100μg/ml

不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS+Zeocin培養(yǎng)基，都必需存放4℃條件下，有效期1～2周。

2.7MGY

MinimalGlycerolMedium（最小甘油培養(yǎng)基）

（34%YNB；1%甘油；4*10%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4℃保存，保存期為2個月。

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2.8MGYH

MinimalGlycerolMedium+Histidine（最小甘油培養(yǎng)基+0.004%組氨酸）

在1000ml的MGY培養(yǎng)基中參與10ml的100*H母液混勻，4℃保存，保存期為2個月。

2.9RD

RegenerationDextroseMedium（葡萄糖再生培養(yǎng)基）

（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10%生物素；0.005%氨基酸）1.將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；2.冷卻后于45℃水??；

3.將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。

-5

2.10RDH

RegenerationDextroseMedium+Histidine（葡萄糖再生培養(yǎng)基+0.004%組氨酸）

在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在參與10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD一致。4℃保存。

2.11RD及RDH平板的制備

1.將186g的山梨醇和15~20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60℃水浴；2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；

3.迅速制備平板。4℃可保存數(shù)月。

2.12RD及RDH的TOP瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）

1.將186g的山梨醇和7.5~10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60℃水??；

2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；

3.將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。

2.13MD與MDH

MinimalDextroseMedium+（Histidine）最小葡萄糖培養(yǎng)基+（0.004%組氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10%生物素；2%葡萄糖）

1.100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml

即可；

2.如配制MDH，可在上述的MD中參與10ml的100*H即可；

3.如配制平板，可無菌水的滅菌前，參與15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。

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2.14SOC培養(yǎng)基：

Tryptonl％

YeastExtract0.5％NaCl0.05％Glucose(1mol/L)2%

121℃高壓滅菌20min，冷卻后，4℃保存。

母液的配置注：

10*YNB（含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基）4℃保存。34g酵母

基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。

500*B（0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。

100*H（0.4%Histidine組氨酸）4℃保存保存期為1年。400mg的L-組氨酸溶于

100ml水中，（加熱至50℃以促進溶解），過濾除菌。

10*D（20Txtrose葡萄糖）保存期為1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅

菌15min或過濾除菌。

10*M（5%Methanol甲醇）保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，

過濾除菌。

10*GY（10%Glycerol甘油）保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻

后，高壓滅菌或過濾除菌。

100*AA（0.5%of