第三節(jié)紫外可見(jiàn)分光光度分析方法藥劑

第三節(jié)紫外－可見(jiàn)分光光度

分析方法一、定性鑒別：1、依據(jù)：多數(shù)有機(jī)化合物具有吸收光譜特征。特征值：

同一化合物，在相同條件下應(yīng)具有相同的吸收光譜（或吸收曲線）吸收光譜形狀12、定性鑒別方法：對(duì)比法：（1）對(duì)比吸收光譜特征數(shù)據(jù)（2）對(duì)比吸光度比值或吸光系數(shù)比值（3）對(duì)比吸收光譜一致性2安宮黃體酮（M=386.53)炔諾酮（M=298.43)它們?chǔ)薽ax相同，但吸光系數(shù)有明顯差別3例如：維生素B12的鑒別：藥典規(guī)定：對(duì)比吸光度比值或吸光系數(shù)比值4醋酸氫化可的松醋酸潑尼松醋酸可的松三種甾體激素的紫外吸收光譜（10μg/ml甲醇)E相同，λmax相同，但吸收曲線不同240nm5特別指出：在相同條件下，具有相同吸收光譜的物質(zhì)，可能是同一物質(zhì)。若在相同條件下，兩物質(zhì)吸收光譜明顯不同，則肯定不是同一物質(zhì)。6二、純度檢測(cè)（一）雜質(zhì)檢查三種情況1、在某一波長(zhǎng)區(qū)，化合物無(wú)明顯吸收，而雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收方法：作此波長(zhǎng)區(qū)內(nèi)化合物的吸收光譜，與純物質(zhì)的吸收光譜比較無(wú)吸收或弱吸收——無(wú)雜質(zhì)有較強(qiáng)吸收——有雜質(zhì)7例：乙醇和環(huán)已烷256nm無(wú)吸收苯256nm有吸收256122、含有苯1、不含苯A82、化合物在某波長(zhǎng)區(qū)有強(qiáng)吸收，雜質(zhì)無(wú)吸收或弱吸收：方法：（1）測(cè)定化合物在此波長(zhǎng)區(qū)的吸光系數(shù)，與純物質(zhì)的吸光系數(shù)比較吸光系數(shù)值不變——無(wú)雜質(zhì)吸光系數(shù)值降低——有雜質(zhì)9（2）作此波長(zhǎng)區(qū)化合物的吸收光譜，與同濃度的純物質(zhì)的吸收光譜比較純物質(zhì)有雜質(zhì)Aλ同濃度，含雜質(zhì)：A減小，峰高變矮。103、化合物有較強(qiáng)吸收，而雜質(zhì)在此波長(zhǎng)區(qū)比化合物有更強(qiáng)吸收方法：測(cè)量化合物在此波長(zhǎng)處吸收系數(shù)或吸收光譜，與純物質(zhì)比較吸光系數(shù)增大或吸收曲線變形同濃度，含雜質(zhì)：A增大，E值增大。有雜質(zhì)11（二）雜質(zhì)的限量檢測(cè)1、化合物無(wú)吸收，而雜質(zhì)有吸收：規(guī)定化合物在該波長(zhǎng)的吸收值不能大于某一數(shù)值。例：腎上腺素310nm無(wú)吸收腎上腺酮310nm有吸收規(guī)定：腎上腺酮含量<0.06%則腎上腺素（2mg/ml的HCl溶液)A≤0.0512注：濃度為2mg/ml的腎上腺素HCl溶液，要求含腎上腺酮小于0.06%132、在化合物處雜質(zhì)無(wú)吸收，而在化合物處雜質(zhì)有吸收規(guī)定：化合物在與處吸光度比值為一限量例：碘磷：雜質(zhì)無(wú)吸收有吸收純碘磷：，含雜質(zhì)規(guī)定：碘磷藥品14三、單組分的定量方法依據(jù)：Lambert-Beer定律

A=ECl注意：1、為提高測(cè)量準(zhǔn)確度和靈敏度，應(yīng)選擇峰頂較平的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量15A測(cè)量波長(zhǎng)測(cè)量波長(zhǎng)162、應(yīng)選不易受干擾的吸收峰波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定。420500BAnmA(B.)1-亞硝基-2-萘酚-3.6磺酸及其(A.)鈷絡(luò)合物的吸收光譜測(cè)量波長(zhǎng)173、一般不選擇光譜中靠短波長(zhǎng)的末端吸收波長(zhǎng)作測(cè)量波長(zhǎng)。4、測(cè)定波長(zhǎng)應(yīng)大于溶劑的極限波長(zhǎng)。5、吸收池在測(cè)量波長(zhǎng)下，不吸收或極弱吸收。同系列測(cè)量，盡量使用同一吸收池或校正吸收池?？瞻着c試樣吸收池要配對(duì)，且固定吸收池，固定方向。18單組分定量方法：（一）吸光系數(shù)法(1)配制一定濃度的樣品溶液，測(cè)量某波長(zhǎng)下的吸光度A值（2）查文獻(xiàn)得吸光系數(shù)或或同條件下測(cè)量出或（3）計(jì)算樣品濃度：再求含量。19例：B12的含量測(cè)定針劑：標(biāo)示量為250μg/ml,即0.250mg/ml操作（1）取1.00ml樣品配成10.00ml溶液（2）取上述溶液盛于1.00cm吸收池中，在361nm處測(cè)量A值為0.507。已知B12在361nm處的E1%1cm,361=207求：（1）測(cè)定液中B12的濃度（2）B12針劑樣品中組分B12的含量（3）求樣品標(biāo)示量的百分含量20解：（1）根據(jù)已知：A=0.507則：E1%1cm,361=20721吸光系數(shù)法要求：（1）A與C是一條過(guò)原點(diǎn)或近似過(guò)原點(diǎn)的直線關(guān)系（2）要測(cè)量或能查到或(3)單色光對(duì)儀器要求高22（二）校正曲線法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法）操作：1、配制5~7個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同一條件下測(cè)量吸光度值。C1，C2，C3，C4，C5A1，A2，A3，A4，A52、作A~C標(biāo)準(zhǔn)曲線（稱工作曲線）或求回歸方程。3、相同條件下配制樣品溶液，并測(cè)量吸光度A樣4、從工作曲線或回歸方程中求C樣23A0A樣C樣C圖11-19標(biāo)準(zhǔn)曲線24標(biāo)準(zhǔn)曲線法要求：1、A與C是一條直線或近似一條直線關(guān)系2、測(cè)量過(guò)程中，要求儀器的工作狀態(tài)及測(cè)量條件保持一致。3、樣品濃度Cx應(yīng)落在線性范圍內(nèi)4、標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣組成相似。5、A=a+bC，a要比b小102以上25（三）對(duì)照法操作1、在相同條件下配制一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液和一個(gè)樣品溶液（C標(biāo)與C樣）待測(cè)樣品(Unknownsample)標(biāo)準(zhǔn)樣品(Referencesample)26（三）對(duì)照法操作2、在相同條件下測(cè)量A標(biāo)和A樣3、計(jì)算：27對(duì)照法要求：1、A與C是一條過(guò)原點(diǎn)或近似過(guò)原點(diǎn)的直線關(guān)系:A=a+bC要求a=02、測(cè)量過(guò)程中，要求儀器的工作狀態(tài)及測(cè)量條件保持一致。3、樣品濃度Cx應(yīng)落在線性范圍內(nèi),C樣與C標(biāo)盡量接近4、標(biāo)準(zhǔn)溶液與試樣組成相似。28

紫外-可見(jiàn)分光光度法應(yīng)用測(cè)定弱酸（堿）的離解常數(shù)、配合物的平衡常數(shù)及組成。例：HA的離解常數(shù)測(cè)量波長(zhǎng)下：HA與A-都有吸收高酸度時(shí)：酸幾乎以HA形式存在高堿度時(shí)：酸幾乎以A-形式存在29酸度在二者之間：酸以HA和A-形式存在

30四、同時(shí)測(cè)定多組分的定量方法——計(jì)算分光光度法依據(jù)：1、Lambert-Beer定律2、吸光度的加和性3、化學(xué)計(jì)量學(xué)31Aλλ2λ1abababAAλ2λ2λ1λ1λλ圖11-20混合組分吸收光譜的三種相干情況示意圖（1）（3）簡(jiǎn)單的情況32解線性方程組法：

1、a、b兩組分光譜相互干擾：設(shè)l=1cmAbaλλ2λ133解得：34計(jì)算分光光度法（一）雙波長(zhǎng)法1、等吸收雙波長(zhǎng)消去法：測(cè)組分a選測(cè)量波長(zhǎng)λ2參比波長(zhǎng)λ1，abλ2Aλ1λ35波長(zhǎng)選擇原則：1、干擾組分b在兩波長(zhǎng)處的吸光度相等。即要求：b組分在a組分吸收曲線重疊處至少有一個(gè)峰或谷2、待測(cè)組分在兩波長(zhǎng)處的吸光度的差值應(yīng)足夠大。有最高的靈敏度和準(zhǔn)確度36baλAλ2λ3λ4λ137

常選被測(cè)組分的λmax作測(cè)量波長(zhǎng)，干擾組分的等吸收波長(zhǎng)作參比波長(zhǎng)。方法：

在光譜圖上用作圖法尋找λ1與λ238abλ2Aλ1λ作圖法選擇λ1和λ2等吸收雙波長(zhǎng)消去法示意圖λ′2λ

′139abλ2Aλ1λ作圖選擇λ1和λ2等吸收雙波長(zhǎng)消去法示意圖40abλ2Aλ1λ41苯甲酸鈉安鈉咖樣品咖啡因200230257253272300λnm00.50.40.30.20.10.6A安鈉咖、苯甲酸鈉、咖啡因吸收曲線42安鈉咖中咖啡因與苯甲酸鈉的含量測(cè)定苯甲酸鈉：等吸收波長(zhǎng)253nm~272nm咖啡因：等吸收波長(zhǎng)230nm~257nm例：測(cè)定苯甲酸鈉：則咖啡因是干擾組分測(cè)量波長(zhǎng)參比波長(zhǎng)43同理：測(cè)定咖啡因：則苯甲酸鈉是干擾組分測(cè)量波長(zhǎng)參比波長(zhǎng)44A345687911021AAλλλ圖11-22幾種吸收光譜的組合干擾組分有等吸收點(diǎn)，可用等吸收雙波長(zhǎng)消去法干擾組分無(wú)等吸收點(diǎn)，不可用等吸收雙波長(zhǎng)消去法干擾組分452、系數(shù)倍率法原理：假設(shè)某一干擾組分在選定兩個(gè)波長(zhǎng)λ1和λ2處測(cè)得吸光度的比值為K，即K稱掩蔽系數(shù)46λ2λ1λAAλ1Aλ2干擾組分y系數(shù)倍率法原理干擾組分影響的消除47例：混合樣品：由x，y組分組成現(xiàn)被測(cè)組分是x，干擾組分是y波長(zhǎng)選擇：1、選被測(cè)組分最大吸收波長(zhǎng)作測(cè)量波長(zhǎng)λ22、在干擾組分吸收曲線上找出參比波長(zhǎng)λ148對(duì)λ1的要求：盡量使干擾組分在λ1與λ2處的吸光度比值足夠大，使得：

Aλ1>Aλ249yxAλλ2λ1圖系數(shù)倍率法x：被測(cè)組分y：干擾組分50測(cè)量方法：1、在λ2與λ1處測(cè)得干擾組分y對(duì)照品溶液的吸光度與。計(jì)算掩蔽系數(shù)K2、在λ2與λ1處分別測(cè)得混合樣品的吸光度值與。計(jì)算51（二）導(dǎo)數(shù)光譜法定義：將一個(gè)吸收光譜寫成波長(zhǎng)的函數(shù)，即A=cE=c·f(λ),則它的導(dǎo)函數(shù)的圖像就是導(dǎo)數(shù)光譜。521.導(dǎo)數(shù)光譜的波形和特點(diǎn)1）零階光譜的極大在奇數(shù)階的導(dǎo)數(shù)中相應(yīng)為零（n=1,3,···），而在偶數(shù)階的導(dǎo)數(shù)（n=2,4,···）相應(yīng)于一個(gè)極值（極小和極大交替出現(xiàn)）。2）零階光譜上的拐點(diǎn)，在奇數(shù)階導(dǎo)數(shù)中產(chǎn)生極值，在偶數(shù)階導(dǎo)數(shù)中為零。3）極值數(shù)=導(dǎo)數(shù)階數(shù)+1532.導(dǎo)數(shù)光譜的定量原理：一階導(dǎo)數(shù)二階導(dǎo)數(shù)三階導(dǎo)數(shù)n階導(dǎo)數(shù),可消除干擾543.導(dǎo)數(shù)光譜法定量數(shù)據(jù)的測(cè)量（1）基線法，以d為定量依據(jù)。（2）峰-谷法，以p為定量依據(jù)。（3）峰-零法，以z為定量依據(jù)。55定量方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線法56五.紫外吸收光譜用于有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)研究一、有機(jī)化合物的紫外吸收光譜：（一）飽和碳?xì)浠衔镫娮咏Y(jié)構(gòu)：σ電子躍遷類型：吸收峰位：<150nm（在真空紫外區(qū)）作用：常用作溶劑（在紫外光譜中）57（二）含孤立助色團(tuán)和生色團(tuán)的飽和化合物1、含雜原子的飽和基團(tuán)（助色團(tuán)）化合物電子結(jié)構(gòu)：n躍遷類型：吸收峰位：200nm左右，多數(shù)小于200nm582、含孤立雜原子不飽和基團(tuán)（生色團(tuán)）的化合物和孤立雙鍵、三鍵化合物：電子結(jié)構(gòu)：n,π躍遷類型及吸收峰位：

200nm左右（一般<200nm)弱吸收200nm左右強(qiáng)吸收200~400nm弱吸收59例：丙酮：CH3-C-CH3

O例：丙酮：CH3-C-CH3

Oλmax194nmε190弱吸收λmax166nmε16000強(qiáng)吸收λmax279nmε15弱吸收60（三）共軛烯烴電子結(jié)構(gòu)：π躍遷類型：吸收峰位：比含孤立雙鍵的吸收峰波長(zhǎng)長(zhǎng)吸收強(qiáng)度：比含孤立雙鍵的吸收峰強(qiáng)度大隨共軛體系增加，峰的波長(zhǎng)增長(zhǎng)（長(zhǎng)移），吸收強(qiáng)度增大61（四）不飽和醛、酮、酸和酯（1）雙鍵和羰基未形成共軛化合物電子結(jié)構(gòu)：n、π躍遷類型：C=C為躍遷C=O為和躍遷吸收峰位：躍遷在200nm左右有強(qiáng)吸收

躍遷在280nm有吸收62（2）α、β不飽和醛、酮中吸收峰位長(zhǎng)移，吸收強(qiáng)度增大（3）溶劑極性增加：使躍遷紅移，使躍遷紫移（4）酸和酯上的C=O與-OH和-OR基相連：使躍遷紅移，使躍遷紫移63（五）芳香族化合物1、苯的取代苯：苯：環(huán)狀共軛結(jié)構(gòu)電子結(jié)構(gòu)：π躍遷類型：吸收峰位：約180nm，E1吸收帶，ε：60000，強(qiáng)吸收約200nm，E2吸收帶，ε：8000，強(qiáng)吸收255nm，B吸收帶，ε：215，弱吸收64苯環(huán)上有取代基時(shí)：（1）苯的三個(gè)吸收帶長(zhǎng)移（2）ε值增大（3）B帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)變得簡(jiǎn)單化2、芳雜環(huán)化合物；飽和雜環(huán)化合物λmax<200nm芳雜環(huán)化合物才有紫外吸收65（二）有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)研究1、從吸收光譜中初步推斷官能團(tuán)在200nm~800nm無(wú)吸收，可能是（1）飽和脂肪族和碳?xì)浠衔铮?）含飽和雜原子的脂肪族類化合物（3）無(wú)C=O，-CHO，-COOR等66在210~250nm有吸收帶：可能是含兩個(gè)共軛單位在260~300nm有強(qiáng)吸收：可能含3~5個(gè)共軛單位在250~300nm有弱吸收：

表示存在C=O基在250~300nm有中強(qiáng)吸收，且含有振動(dòng)結(jié)構(gòu)，表示有苯環(huán)存在化合物有色：表明分子中含5個(gè)以上共軛生色團(tuán)67（二）異構(gòu)體的推定（三）化合物骨架的推定68光電比色法（可見(jiàn)分光光度法）是對(duì)能吸收可見(jiàn)光的有色溶液的測(cè)定方法：顯色反應(yīng)類型：配位反應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、縮合反應(yīng)等。六、光電比色法（P212）691、顯色反應(yīng)及其條件：P212（1）顯色反應(yīng)要求被測(cè)物質(zhì)與所生成的有色物質(zhì)之間必須有確定的定量關(guān)系。反應(yīng)靈敏度高，顯色劑的選擇性好顯色劑本身的顏色與顯色反應(yīng)生成物的顏色有明顯區(qū)別生成的有色化合物性質(zhì)穩(wěn)定，組成恒定70（2）顯色反應(yīng)條件的影響因素酸度：影響顯色劑顏色變化影響有機(jī)酸顯色劑的配位反應(yīng)例：Fe3+與磺基水楊酸根(C7H4O6S)2-反應(yīng)：pH1.8~2.5Fe(C7H4O6S)+紅褐色4~8Fe(C7H4O6S)-2褐色8~11.5Fe(C7H4O6S)3-3黃色>12Fe(OH)371吸光度隨pH變化曲線圖適宜酸度范圍；A值相對(duì)穩(wěn)定所對(duì)應(yīng)的酸度范圍A72顯色劑的濃度：濃度太小，顯色反應(yīng)不完全濃度太大，可能改變顯色反應(yīng)的生成物的組成例：Fe3+與SCN-反應(yīng)：SCN-濃度較低時(shí)，生成FeSCN2+SCN-

≈0.1mol/L,生成Fe(SCN)2+SCN->0.2mol/L,生成Fe(SCN)64-

73吸光度隨顯色劑用量變化曲線圖A顯色劑用量適宜顯色劑用量范圍：A值相對(duì)穩(wěn)定所對(duì)應(yīng)的顯色劑用量范圍74吸光度隨時(shí)間變化曲線圖A時(shí)間顯色時(shí)間顯色時(shí)間不同，生成物的穩(wěn)定性不同適宜時(shí)間范圍：A值相對(duì)穩(wěn)定所對(duì)應(yīng)的時(shí)間范圍75*反應(yīng)溫度*溶劑與試劑*試樣中共存離子的干擾的消除a.加入合適的掩蔽劑b.改變干擾離子價(jià)態(tài)c.選擇合適的顯色條件d.選擇不受干擾的測(cè)定波長(zhǎng)e.利用參比溶液抵消干擾f.預(yù)先采用萃取，離子交換，柱層析等方法分離干擾離子。76定量方法：常用標(biāo)準(zhǔn)曲線法77紫外－可見(jiàn)分光光度法在藥品食品檢測(cè)中的應(yīng)用維生素類的測(cè)定食品添加劑的測(cè)定糖類測(cè)定其他各類成分的測(cè)定781.酒葡萄原汁中VC的測(cè)定準(zhǔn)確稱取5.00g樣品，加入10mLHCl溶液（1：3），快速攪勻，然后用高速冷凍離心機(jī)以10000r/min離心10min,取2mL澄清液，加入盛有1mLHCl溶液(1:3)的容量瓶中，用蒸餾水定容至50mL。取50mL的容量瓶，加入定容后的樣液2mL,1mLHCl溶液（1：3），0.3mLCu(NO3)2溶液，然后在70℃的恒溫水浴中加熱13min后，以冰水冷卻，以蒸餾水作空白，243.8nm下測(cè)定吸光度。用樣液與經(jīng)Cu2+加熱處理后的樣液吸光度值之差，查標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，即可計(jì)算樣品中的VC。792.VB6的測(cè)定取系列標(biāo)準(zhǔn)維生素B6溶液于10mL比色管中，加入0.10mol/LHAc溶液3.5mL,用水稀釋至刻度，搖勻。用1cm比色皿，以試劑空白為參比，于295nm處測(cè)定吸光度，求得工作曲線。取系列標(biāo)準(zhǔn)維生素B6片劑或針劑，配制成0.2mg/mL溶液與標(biāo)準(zhǔn)系列一樣進(jìn)行測(cè)定，從工作曲線法即可求得維生素B6含量。80食品添加劑的測(cè)定苯甲酸的測(cè)定硝酸鹽的測(cè)定食品中甜蜜素的測(cè)定食品中香蘭素的測(cè)定食用合成色素的同時(shí)測(cè)定卵磷脂的測(cè)定81苯甲酸的測(cè)定分別取0.05mg/mL苯甲酸溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.5mL于125mL分液漏斗中，加入20mL飽和氯化鈉溶液，10mL(1:1)HCl溶液和25mL乙醚。充分振蕩5min,靜置分層后棄去無(wú)機(jī)相，以試劑空白為參比，在223nm測(cè)定其吸光度，求得工作曲線。樣品處理后同前操作。82食品中甜蜜素(環(huán)己基氨基磺酸鈉)的測(cè)定分別吸取甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.0g/L）0,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00mL于250mL分液漏斗中，各加入10％硫酸溶液100mL,乙酸乙酯80mL振搖，提取2min,棄水相。用30、20、20mL0.1mol/L氫氧化鈉溶液振搖提取3次，每次1min，合并水相于另一250mL分液漏斗中，往水相中加入環(huán)己烷10mL,振搖提取1min，棄去環(huán)己烷，加入10％硫酸溶液15mL，環(huán)己烷10.0mL,20g/L次氯酸鈉溶液5mL,振搖2min，再加入20g/L次氯酸鈉溶液5mL,振搖2min，棄水相，先后用0.1mol/LNaOH溶液，蒸餾水各50mL洗滌環(huán)己烷層，經(jīng)脫脂棉將環(huán)己烷層濾于10mL比色管中，用環(huán)己烷作參比，于波長(zhǎng)304nm處測(cè)定吸光度。83食用合成色素的同時(shí)測(cè)定我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)允許使用莧菜紅，胭脂紅，檸檬黃，日落黃及靛藍(lán)5種食用合成色素，它們毒性雖較小，但其用量必須嚴(yán)格控制，最大量規(guī)定為：莧菜紅、胭脂紅為0.05g/kg,檸檬黃、日落黃和靛藍(lán)為0.1g/kg。測(cè)定：取飲料25mL（除去CO2）,加入0.2g脫脂羊毛及20％檸檬酸溶液20mL，加熱至70～80℃，使合成色素完全被羊毛吸附，然后用70℃的檸檬酸溶液（pH=4）洗滌羊毛2～3次84再用蒸餾水洗滌至中性。如含天然色素，再用甲醇－甲酸溶液沖洗1～3次