竹節(jié)參皂苷抗風(fēng)濕作用有效性與安全性評(píng)價(jià)

發(fā)現(xiàn)和甄別臨床前研究臨床研究申報(bào)及后續(xù)工作基礎(chǔ)和應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)并篩選藥物來(lái)源藥學(xué)藥理學(xué)毒理學(xué)Ⅰ期臨床試驗(yàn)Ⅱ期臨床試驗(yàn)Ⅲ期臨床試驗(yàn)填寫(xiě)新藥申請(qǐng)后續(xù)登記活動(dòng)

新藥研發(fā)項(xiàng)目IV期臨床試驗(yàn)第一頁(yè)，共30頁(yè)。

臨床前研究前言有效性安全性總結(jié)

新藥臨床前研究的內(nèi)容藥學(xué)

定型鑒別、定量測(cè)定、理化性質(zhì)、合成路線和制劑工藝、穩(wěn)定性及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案制訂等。藥理學(xué)

藥效學(xué)、一般藥理學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)及可能的作用機(jī)制研究。

毒理學(xué)

急性毒性、長(zhǎng)期毒性、特殊毒性及其它毒性（刺激性、溶血、過(guò)敏、藥物依賴(lài)性、）研究

。第二頁(yè)，共30頁(yè)。一、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎簡(jiǎn)介

前言前言有效性安全性總結(jié)前言類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoidarthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，確切病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚。關(guān)節(jié)的疼痛與炎癥是風(fēng)濕病中較為常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)，因此鎮(zhèn)痛與抗炎是風(fēng)濕病治療學(xué)中最主要的內(nèi)容。常用藥物：常規(guī)藥物治療(如非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素)、生物制劑治療等第三頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參簡(jiǎn)介

前言前言有效性安全性總結(jié)前言竹節(jié)參在土家族苗族聚居區(qū)民間醫(yī)療中被譽(yù)為“草藥之王”,屬珍稀瀕危的名貴“七類(lèi)”中草藥。竹節(jié)參為五加科植物竹節(jié)參PanaxjaponicusC.A.Mey.的干燥根莖。作用：散瘀止血、消腫止痛、祛痰止咳、補(bǔ)虛強(qiáng)壯的功效，用于治療癆嗽咯血、跌撲損傷、咳嗽痰多、病后虛弱等癥。第四頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參簡(jiǎn)介

前言前言有效性安全性總結(jié)前言

竹節(jié)參的主要化學(xué)成分皂苷，其結(jié)構(gòu)主要是齊墩果烷型五環(huán)三葩皂苷和達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜皂昔。各類(lèi)型三萜類(lèi)皂苷的母核結(jié)構(gòu)第五頁(yè)，共30頁(yè)。誘導(dǎo)式轉(zhuǎn)基因式自發(fā)式其他誘導(dǎo)式TNF-α轉(zhuǎn)基因型IL-1Ra-/-模型K/BxN轉(zhuǎn)基因模型HTLV-1小鼠模型MRL/Mpj-lpr/lpr(MRL/lpr)小鼠

降植烷誘導(dǎo)型膠原抗體誘導(dǎo)型前炎癥因子誘導(dǎo)型卵蛋白誘導(dǎo)型

角叉菜膠誘導(dǎo)型avridine誘導(dǎo)型蛋白多糖誘導(dǎo)型軟骨低聚體基質(zhì)蛋白誘導(dǎo)型嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型佐劑誘導(dǎo)型（AA）膠原誘導(dǎo)型（CIA）鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)型（SCW）第六頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明種小鼠,體重20±2g,雌雄各半。1.1抗炎實(shí)驗(yàn)角叉菜膠所致小鼠足腫脹模型

(1)分組給藥

隨機(jī)分為五組,每組10只。Ⅰ組為control,Ⅱ組為吲哚美辛，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組為T(mén)SPJ低、中、高劑量組。

(2)角叉菜膠所致小鼠足腫脹模型按藥理實(shí)驗(yàn)方法，各鼠右足趾皮下注射1%角叉菜膠(50μL/只)致炎。(3)

給藥方式本次試驗(yàn)為預(yù)防性試驗(yàn),每組連續(xù)灌胃給藥10d,d10給藥后1h后致炎。(4)檢測(cè)指標(biāo)在致炎后0.5,1,2,3,4,5h時(shí)采用自制的容量測(cè)定儀,以排水法計(jì)算其右足趾體積,計(jì)算各組的腫脹度和腫脹抑制率。第七頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性抗氧化實(shí)驗(yàn)(1)分組給藥隨機(jī)分為五組,每組10只。I組為control,Ⅱ組為吲哚美辛,Ⅲ、IV、V組為T(mén)SPJ低、中、高劑量組。(2)給藥方式和時(shí)間本次試驗(yàn)為預(yù)防性試驗(yàn),每組連續(xù)灌胃給藥10d。(3)檢測(cè)指標(biāo)末次給藥后1h摘眼球取血,靜置，分離血清,分裝，-20℃保存。按GSH-PX、SOD和MDA試劑盒要求進(jìn)行操作,分別檢測(cè)小鼠血清GSH-PX、SOD活性及過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量。第八頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)(1)分組給藥隨機(jī)分為五組,每組10只。I組為control,Ⅱ組為吲哚美辛,Ⅲ、IV、V組為T(mén)SPJ低、中、高劑量組。(2)給藥方式和時(shí)間本次試驗(yàn)為預(yù)防性試驗(yàn),每組連續(xù)灌胃給藥10d。(3)檢測(cè)指標(biāo)末次給藥后1h摘眼球取血,分離血清,-20℃保存。按試劑盒操作方法,檢測(cè)小鼠血清IL-1、TNF-a含量。第九頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果竹節(jié)參總皂苷對(duì)角叉菜膠所致小鼠足腫脹的抑制結(jié)果角叉菜膠是常用的急性炎癥模型刺激物,局部注射引起明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加,造成局部水腫,炎性細(xì)胞浸潤(rùn),形成"紅腫痛熱"等急性炎癥癥狀。使用吲哚美辛在致炎后0.5-4h就減輕足腫脹,持續(xù)5小時(shí)以上,與control組相比,差異具有顯著性(P<0.01),TSPJ能減輕角叉菜膠所致小鼠右后足的紅、腫等癥狀,有明顯差異(P<0.05或P<0.01),但是起效緩慢。見(jiàn)表1.1。第十頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性竹節(jié)參總皂昔對(duì)血清中GSH-PX、SOD活性及MDA含量的影響在本次試驗(yàn)中,TSPJ能明顯提高機(jī)體抗氧化能力,GSH-PX活性和SOD活性明顯提高,對(duì)自由基的清除能力加強(qiáng),自由基代謝產(chǎn)物MDA產(chǎn)生量明顯減少,從而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較好的保護(hù)作用,這也與其滋補(bǔ)強(qiáng)壯、抗炎、消腫止痛作用相符合。見(jiàn)表2.4。

第十一頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠血清中IL-1,TNF-a含量的影響如前所述,炎癥反應(yīng)中除了前列腺素外,IL-1、TNF-a等其他炎癥因子也參與炎癥網(wǎng)絡(luò)并且可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),吲哚美辛組小鼠血清中IL-1、TNF-a水平明顯下降,與control組比較,差異性極顯著(P<0.001),表明吲哚美辛參與了干擾IL-1、TNF-a的生成,TSPJ組小鼠血清TNF-a水平下降,差異性顯著(P<0.01),對(duì)IL-1影響不大,原因不明。第十二頁(yè)，共30頁(yè)。一、竹節(jié)參總皂苷抗炎活性實(shí)驗(yàn)研究

前言有效性總結(jié)安全性1.3竹節(jié)參總皂苷對(duì)小鼠抗炎作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

結(jié)果表明,竹節(jié)參總皂苷中高劑量均能明顯減輕角叉菜膠所致小鼠右后足的紅、腫等癥狀,與control組比較,50mg/kgTSPJ組在致炎后1~3h,100mg/kgTSPJ組在致炎后0.5~4h能減輕小鼠足腫脹,有明顯差異。TSPJ三個(gè)劑量組的小鼠血清MDA明顯降低(P<0.05),有量效關(guān)系;竹節(jié)參總皂苷能恢復(fù)小鼠血清中GSH-PX、SOD的活力,提示TSPJ具有減少炎癥反應(yīng)時(shí)自由基生成,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的作用。各類(lèi)細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中有重要功能,IL-1,TNF-a能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子,增進(jìn)白細(xì)胞與之粘著,也可引起急性炎癥的發(fā)熱,TNF還能促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集和激活間質(zhì)組織釋放蛋白水解酶。本實(shí)驗(yàn)中TSPJ治療組小鼠血清IL-1、TNF-a水平明顯下降水平下降,因此抑制IL-1、TNF-a的生成可能是竹節(jié)參總皂苷抗炎作用機(jī)制之一。

綜上所述,TSPJ具有明顯的抗炎功能,抑制IL-1、TNF-a的生成可能是竹節(jié)參總皂苷抗炎作用的重要機(jī)制。第十三頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參總皂苷對(duì)CIA大鼠組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變的影晌

前言有效性總結(jié)安全性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)Wistar大鼠,體重200±10g,雌雄各半。2.1試驗(yàn)方法2.1.1動(dòng)物分組及處理

A. 正常組:注射液為無(wú)菌液體石蠟;B. 模型組:制作CIA大鼠模型;C. 雷公藤組:制作CIA大鼠模型,按雷公藤甲素計(jì)25μg/kg灌胃給藥;D.TSPJ小劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷25mg/kg灌胃給藥;E. TSPJ中劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷50mg/kg灌胃給藥;F. TSPJ大劑量組:制作CIA大鼠模型,竹節(jié)參總皂苷100mg/kg灌胃給藥;2.1.2動(dòng)物模型

膠原誘導(dǎo)型（CIA）第十四頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參總皂苷對(duì)CIA大鼠組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變的影晌

前言有效性總結(jié)安全性2.2觀察項(xiàng)目關(guān)節(jié)炎病變程度足爪容積的測(cè)定大鼠體重變化免疫器官重量檢測(cè)

ConA誘導(dǎo)的CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的測(cè)定

CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞IL-2的誘生與檢測(cè)2.2.7CIA大鼠腹腔巨噬細(xì)胞(PMΦ)產(chǎn)生IL-1、IL-6.TNF-a的含量

CIA組織病理組織學(xué)檢測(cè)關(guān)節(jié)超微結(jié)構(gòu)的觀察關(guān)節(jié)滑膜組織中細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的檢測(cè)第十五頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參總皂苷對(duì)CIA大鼠組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變的影晌

前言有效性總結(jié)安全性2.3結(jié)果

TSPJ各劑量組AI評(píng)分也隨著繼發(fā)性炎癥的產(chǎn)生而升高,但與同期的模型組比較有顯著性差異,提示竹節(jié)參總皂苷具有抗CIA的作用,具有量效關(guān)系,但TSPJ并無(wú)快速消除炎癥癥狀的作用,且治療效果比雷公藤治療組稍差。使用TSPJ后,各劑量組腫脹程度從縱向來(lái)看,也隨著繼發(fā)性炎癥的產(chǎn)生而增加,但與同期的模型組(橫向比較)比較有顯著性差異,提示竹節(jié)參總皂苷具有抗CIA的作用,且具有量效關(guān)系,但治療效果比雷公藤治療組稍差。

CIA模型組體重增長(zhǎng)速度減慢或停止,與正常組比較,差異有顯著性(P<0.05),雷公藤治療組體重增長(zhǎng)速度也出現(xiàn)減慢現(xiàn)象,

TSPJ各組體重增長(zhǎng)速度基本正常。

CIA模型可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能亢進(jìn);TSPJ都具有使亢進(jìn)的免疫功能恢復(fù)正常的作用,而雷公藤則直接抑制免疫器官的發(fā)育和增長(zhǎng)。

ConA誘導(dǎo)的CIA大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯低于正常對(duì)照組，TSPJ給藥可以恢復(fù)CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞功能,TPT對(duì)CIA大鼠低下的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)沒(méi)有明顯影響。

TSPJ可使CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞低下的IL-2水平恢復(fù)接近正常組大鼠水平,對(duì)照藥TPT的作用不顯著。第十六頁(yè)，共30頁(yè)。二、竹節(jié)參總皂苷對(duì)CIA大鼠組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)改變的影晌

前言有效性總結(jié)安全性

TSPJ大中劑量能明顯抑制PMΦ產(chǎn)生IL-lβ、IL-6和TNF-a;提示治療劑量的TSPJ可以不同程度地下調(diào)致炎細(xì)胞因子水平,阻斷炎癥通路的惡性循環(huán)。

TSPJ各劑量組病理切片總體情況:皮下軟組織充血水腫減輕,組織間可見(jiàn)少許的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)囊結(jié)構(gòu)完整,關(guān)節(jié)腔內(nèi)未見(jiàn)明顯的纖維蛋白沉積,關(guān)節(jié)滑膜間可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞,部分滑膜仍有一定程度的增生,軟骨細(xì)胞未見(jiàn)明顯增生現(xiàn)象,未見(jiàn)明顯骨小梁溶蝕和骨膠原降解現(xiàn)象。

TSPJ組:各劑量組的滑膜層細(xì)胞性?xún)?nèi)膜無(wú)增厚,細(xì)胞層數(shù)接近正常,細(xì)胞排列均勻,偶見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞間未見(jiàn)明顯的膠原纖維增生,超微結(jié)構(gòu)基本正常。

TSPJ各劑量組關(guān)節(jié)滑膜ICAM-1表達(dá)數(shù)目、面積總和、積分光密度值及平均黑度值均低于模型對(duì)照組,且有著性差異(P<0.05或P<0.01),說(shuō)明TSPJ具有降低CIA關(guān)節(jié)炎癥損傷的作用,其總體效果與陽(yáng)性對(duì)照藥TPT無(wú)明顯差異。第十七頁(yè)，共30頁(yè)。三、結(jié)論

前言有效性總結(jié)安全性竹節(jié)參具有以下作用:(1)提高機(jī)體抗氧化能力,減少自由基對(duì)炎癥組織的損傷;(2)具有減輕炎癥組織中炎癥介質(zhì)PGE和LTB的作用;(3)使炎癥組織中細(xì)胞因子如IL-1B、IL-6.TNF-a等明顯減少;(4)減輕炎癥組織中ICAM-1的產(chǎn)生,使炎癥部位不產(chǎn)生粘連;(5)對(duì)免疫系統(tǒng)具有"雙向調(diào)節(jié)作用",在治療過(guò)程中使亢進(jìn)的免疫功能下調(diào)至正常,不會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似雷公藤和其他免疫抑制劑導(dǎo)致的免疫功能減退。第十八頁(yè)，共30頁(yè)。一、毒性作用類(lèi)別藥物不良反應(yīng)副反應(yīng)后遺效應(yīng)停藥反應(yīng)毒性反應(yīng)變態(tài)反應(yīng)特異質(zhì)反應(yīng)致癌性致畸性致突變性毒性作用藥源性疾病總結(jié)前言有效性安全性第十九頁(yè)，共30頁(yè)。二、臨床前毒理學(xué)評(píng)價(jià)主要內(nèi)容急性毒性、長(zhǎng)期毒性、特殊毒性、局部用藥毒性、過(guò)敏試驗(yàn)、刺激性試驗(yàn)、藥物依賴(lài)性試驗(yàn)。總結(jié)前言有效性安全性第二十頁(yè)，共30頁(yè)。三、竹節(jié)參皂苷粗提物毒性總結(jié)前言有效性安全性1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1藥物、細(xì)胞與試劑

藥物：竹節(jié)參皂苷提取物

細(xì)胞：小鼠單核巨噬白血病細(xì)胞株RAW264.7試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒1.2實(shí)驗(yàn)方法

細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞株的復(fù)蘇：用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái),紫外線照射超凈工作臺(tái)30min,從液氮罐中取出凍存管,迅速將凍存管放到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋(37℃)中迅速解凍,不斷搖動(dòng),待凍存管內(nèi)液體完全溶解(控制在1min內(nèi)),取出用酒精棉球擦拭凍存管外壁,再拿入超凈臺(tái)內(nèi),將凍存管內(nèi)的液體轉(zhuǎn)入15mL離心管,加入2倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,800r/min離心5min,棄去上清液,重懸細(xì)胞,接種到培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。傳代：待細(xì)胞長(zhǎng)至90%后,從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞,小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗,加入3mL10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,用細(xì)胞刮棒沿一個(gè)方向輕輕將細(xì)胞刮下來(lái),將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中,800r/min離心5min,棄去上清液,加入培養(yǎng)液,用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,分裝入培養(yǎng)瓶后,放入培養(yǎng)箱37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。凍存：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí),將細(xì)胞收集起來(lái),將胎牛血清與二甲基亞砜(DMSO)按照9∶1的比列配制好凍存液。然后每管中加入2mL凍存液轉(zhuǎn)移至凍存管中,依次放在4℃中40min、-20℃中40min、-80℃過(guò)夜,第2日轉(zhuǎn)移至液氮灌中保存。第二十一頁(yè)，共30頁(yè)。竹節(jié)參皂苷粗提物不僅毒性小,而且其抗炎效果最好。三、竹節(jié)參皂苷粗提物毒性總結(jié)前言有效性安全性RAW264.7細(xì)胞活力測(cè)定將RAW264.7接種于96孔板,細(xì)胞數(shù)為105個(gè)/mL,每孔100μL,貼壁后,設(shè)置調(diào)零孔(只有培養(yǎng)液)、正常組、給藥組,給藥濃度為5、10、20、40、80μg/mL,每組4個(gè)復(fù)孔,24h后吸取上清液,在每孔中加入含MTT的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4h,然后將上清去掉,每孔加入150μLDMSO,置搖床上低速震蕩10min,使結(jié)晶充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔吸光度。1.2.3RAW264.7細(xì)胞一氧化氮釋放量測(cè)定

將RAW264.7接種96孔板,細(xì)胞數(shù)為105個(gè)/mL,每孔100μL,貼壁后,同時(shí)加入不同提取工藝的竹節(jié)參皂苷(濃度為10、1μg/mL)和1μg/mLLPS作用,設(shè)為空白組、LPS組、LPS＋竹節(jié)參皂苷組,每組4個(gè)復(fù)孔,24h后,取上清液50μL,依次加入GriessⅠ和GriessⅡ各50μL,37℃恒溫箱中反應(yīng)30min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀540nm處測(cè)量各孔吸光度。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示,采用方差分析進(jìn)行多組間差異比較,以Dunnett-t檢驗(yàn)比較兩組間均數(shù)的差異。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在炎癥反應(yīng)中,NO是判斷炎癥最基本的指標(biāo)第二十二頁(yè)，共30頁(yè)。四、竹節(jié)參提取物對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性總結(jié)前言有效性安全性

長(zhǎng)期毒性動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一般指連續(xù)給藥14d以上。本實(shí)驗(yàn)觀察竹節(jié)參提取物灌胃給予大鼠90、180d及恢復(fù)30d的毒性反應(yīng)，考察大鼠長(zhǎng)期給藥的安全性，為竹節(jié)參臨床用藥安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1藥物、動(dòng)物

藥物：竹節(jié)參

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(150±10)g2.2實(shí)驗(yàn)方法

竹節(jié)參提取物的制備

將竹節(jié)參干燥根莖粉碎后，用60%乙醇回流提取3次后，回收乙醇，合并濾液，濃縮，得到竹節(jié)參提取物，提取率為25.8%。2.2.2動(dòng)物分組及給藥方法

將96

只大鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組24只，雌雄各半，分別為竹節(jié)參提取物低、中、高劑量(生藥3．2、6．4、12．8g·kg－1

)組，相當(dāng)于臨床成人用量的25、50、100倍，另設(shè)對(duì)照組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對(duì)照組給予蒸餾水，給藥組給予相應(yīng)劑量的竹節(jié)參提取物。給藥體積為1.0mL·kg－1

，每天1次，每周6次，連續(xù)給藥180d，停藥后恢復(fù)30d。分別于給藥第90、180d以及停藥恢復(fù)30d，每組各取8只大鼠，20%烏拉坦麻醉(0。7mL/100g)后于腹主動(dòng)脈取血，分離血清做血液生化指標(biāo)檢測(cè);同時(shí)取大鼠主要臟器進(jìn)行系統(tǒng)觀察和組織病理學(xué)檢查。第二十三頁(yè)，共30頁(yè)。四、竹節(jié)參提取物對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性總結(jié)前言有效性安全性2.2.3大鼠一般狀況、進(jìn)食量及體重觀察

每天觀察大鼠一般狀況，包括外觀體征、行為活動(dòng)、食欲、大小便;每天記錄大鼠進(jìn)食量;每周稱(chēng)量大鼠體重1次。2.2.4血液學(xué)檢查大鼠腹主動(dòng)脈取血后檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、紅細(xì)胞壓積(HCT)和血小板數(shù)目(PLT)等。2.2.5血液生化學(xué)檢查大鼠腹主動(dòng)脈取血，3000r·min－1離心10min取上層得到血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、總膽固醇(TCHO)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)等主要生化學(xué)指標(biāo)。

系統(tǒng)解剖、臟器指數(shù)檢查和組織病理學(xué)檢查大鼠處死后，立即取出心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腦、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、腎上腺，稱(chēng)重后計(jì)算臟器指數(shù)。另取胃、十二指腸、甲狀腺、胰腺、附睪、前列腺，與心臟等組織一同放入4%多聚甲醛溶液中固定24h后，轉(zhuǎn)入70%乙醇中，進(jìn)行脫水、包埋，組織切片、HE染色，于光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。2.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件，以單因素方差分析(one-wayANOVA)并進(jìn)行多組間差異比較，行Dunnett-t檢驗(yàn)，暫未考慮調(diào)整顯著性水準(zhǔn)。第二十四頁(yè)，共30頁(yè)。四、竹節(jié)參提取物對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性總結(jié)前言有效性安全性2.3

結(jié)果2.3.1對(duì)大鼠一般狀況、進(jìn)食量和體重的影響

給藥期和恢復(fù)期間，各組動(dòng)物外觀正常，活動(dòng)自如，各劑量組大鼠體重、攝食量和糞便等均未見(jiàn)明顯異常。大鼠體重呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，與對(duì)照組比較，各劑量組大鼠無(wú)顯著性差異(見(jiàn)表1)。結(jié)果提示竹節(jié)參提取物對(duì)大鼠一般狀況、進(jìn)食量和體重的進(jìn)食量和體重?zé)o明顯影響。第二十五頁(yè)，共30頁(yè)。四、竹節(jié)參提取物對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性總結(jié)前言有效性安全性2.3.2對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，給藥期間，與對(duì)照組比較，竹節(jié)參提取物中、高劑量組WBC和HCT均明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

＜0.05或P

＜0.01)