藥物分析課件第9章-維生素類藥物分析

基本要求一、掌握維生素類藥物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與分析方法之間的關(guān)系。二、掌握維生素類藥物的鑒別原理與方法。三、掌握三點(diǎn)校正法測(cè)定維生素A的原理、測(cè)定方法與計(jì)算方法。四、掌握維生素D的HPLC含量測(cè)定法和維生素E的GC含量測(cè)定法。五、掌握維生素B1非水溶液滴定法與維生素C碘量法的測(cè)定原理、方法與注意事項(xiàng)。六、熟悉本類藥物其他的含量測(cè)定方法。七、熟悉本類藥物雜質(zhì)檢查方法。八、了解維生素A三點(diǎn)校正法的推導(dǎo)過(guò)程。返回第一頁(yè)，共127頁(yè)。概述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營(yíng)養(yǎng)物資。人體不能合成維生素。第二頁(yè)，共127頁(yè)。

VitA、D2、D3、E、K1

等脂溶性水溶性

VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、葉酸、煙酸、泛酸等。分類按溶解度分返回第三頁(yè)，共127頁(yè)。-H維生素A醇-COCH3維生素A醋酸酯-COC15H31維生素A棕櫚酸酯R:第一節(jié)維生素A第四頁(yè)，共127頁(yè)。為一個(gè)具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、具有UV吸收存在多種立體異構(gòu)化合物第五頁(yè)，共127頁(yè)。VitA2VitA3易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)第六頁(yè)，共127頁(yè)。鯨醇第七頁(yè)，共127頁(yè)?！骰蛴薪饘匐x子存在時(shí)氧化↑共軛多烯側(cè)鏈易被氧化（二）第八頁(yè)，共127頁(yè)。環(huán)氧化物VitA醛VitA酸第九頁(yè)，共127頁(yè)。三氯化銻反應(yīng)（一）條件無(wú)水無(wú)醇CHCl3鑒別試驗(yàn)二、第十頁(yè)，共127頁(yè)。藍(lán)色紫紅第十一頁(yè)，共127頁(yè)。（BP（2000））λmax為326nm一個(gè)吸收峰UV法（二）λmax為350～390nm三個(gè)吸收峰第十二頁(yè)，共127頁(yè)。去水VitA（VitA3）↓VitA第十三頁(yè)，共127頁(yè)。第十四頁(yè)，共127頁(yè)。USP顯色劑磷鉬酸規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP

雜質(zhì)對(duì)照品法顯色劑三氯化銻TLC法（三）第十五頁(yè)，共127頁(yè)。立體異構(gòu)體氧化降解產(chǎn)物合成中間體UV法（一）含量測(cè)定三、維生素A2維生素A3環(huán)氧化物維生素A醛維生素A酸第十六頁(yè)，共127頁(yè)。三點(diǎn)校正法（法定方法）1.原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310~340nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增大吸收度減小；（2）物質(zhì)對(duì)光的吸收具有加和性。第十七頁(yè)，共127頁(yè)。2.波長(zhǎng)的選擇：（1）1

VitA的max（328nm）（2）23

分別在1的兩側(cè)各選一點(diǎn)第十八頁(yè)，共127頁(yè)。測(cè)定對(duì)象VitA醋酸酯第一法等波長(zhǎng)差法=12nm第十九頁(yè)，共127頁(yè)。第二法等吸收比法測(cè)定對(duì)象VitA醇1=325nm,2=310nm,3=334nm第二十頁(yè)，共127頁(yè)。測(cè)定法（1）基本步驟:第一步A的選擇選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除第二十一頁(yè)，共127頁(yè)。注意：

C為混合樣品的濃度第二步求第二十二頁(yè)，共127頁(yè)。第三步求效價(jià)換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：第二十三頁(yè)，共127頁(yè)。第二十四頁(yè)，共127頁(yè)。第二十五頁(yè)，共127頁(yè)。第四步：求標(biāo)示量％第二十六頁(yè)，共127頁(yè)。方法：（2）

第一法維生素A醋酸酯第二十七頁(yè)，共127頁(yè)。判斷是否在326～329nm之間在326～329nm之間改用第二法是否求算并與規(guī)定值比較第二十八頁(yè)，共127頁(yè)。

規(guī)定值差值第二十九頁(yè)，共127頁(yè)。

判斷差值是否超過(guò)規(guī)定值的有一個(gè)以上超過(guò)無(wú)超過(guò)

計(jì)算A328（校正）

用A328計(jì)算第三十頁(yè)，共127頁(yè)。第三十一頁(yè)，共127頁(yè)。03%－15%－3%第二法第二法第三十二頁(yè)，共127頁(yè)。討論VA醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來(lái)；VA醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推導(dǎo)而來(lái)。在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。在測(cè)定前務(wù)必要校正波長(zhǎng)。測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份。第三十三頁(yè)，共127頁(yè)。

VitAD膠丸中VitA的含量測(cè)定

精密稱取本品(規(guī)格10000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物0.1287g至10ml燒杯中，加環(huán)己烷溶解并定量轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；精密量取2.0ml，置另一50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)為328nm，并在下列波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度為第三十四頁(yè)，共127頁(yè)。A300：0.374A316

：0.592A328：0.663A340：0.553A360：0.228A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.344求本品中維生素A占標(biāo)示量的百分含量？第三十五頁(yè)，共127頁(yè)。A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.834A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299

+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)=3.52(2×0.663–0.592–0.553)=0.637第三十六頁(yè)，共127頁(yè)。A328(校正)–A328(實(shí)測(cè))A328(實(shí)測(cè))×100=0.637–0.6630.663×100=-3.92E1%1cm(328nm)=A328(校正)100ms/D=0.637100×0.1287/1250=61.87第三十七頁(yè)，共127頁(yè)。供試品中維生素A效價(jià)=E1%1cm(328nm)×1900=61.87×1900=117553（IU/g）標(biāo)示量%=VA效價(jià)(IU/g)×每丸內(nèi)容物平均裝量(g/丸)標(biāo)示量(IU/丸)×100%=117553×0.0798510000×100%=93.9%第三十八頁(yè)，共127頁(yè)。適用于維生素A醇（等吸收比法）第一法無(wú)法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法第三十九頁(yè)，共127頁(yè)。水溶性脂溶性第四十頁(yè)，共127頁(yè)。判斷max是否在323～327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定計(jì)算是否第四十一頁(yè)，共127頁(yè)。判斷A300/A325是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測(cè)定計(jì)算A325(校正)第四十二頁(yè)，共127頁(yè)。第四十三頁(yè)，共127頁(yè)。03%－3%第四十四頁(yè)，共127頁(yè)。三氯化銻比色法（二）優(yōu)點(diǎn)簡(jiǎn)便快速λmax618nm～620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定（5~10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差≤1℃專屬性差三氯化銻有腐蝕性（二）藍(lán)色+3SbClVitA返回第四十五頁(yè)，共127頁(yè)。第二節(jié)維生素D維生素D2一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)第四十六頁(yè)，共127頁(yè)。維生素D3第四十七頁(yè)，共127頁(yè)。開(kāi)環(huán)的甾體：具有甾類化合物的顯色反應(yīng)，可用于鑒別。手性碳原子：具有旋光性，可用于鑒別。

多烯：可進(jìn)行紫外檢測(cè)。

第四十八頁(yè)，共127頁(yè)。二、鑒別試驗(yàn)1.顯色反應(yīng)醋酐--硫酸反應(yīng)D2

黃紅紫綠

D3

黃紅紫、藍(lán)綠綠三氯化銻反應(yīng)橙紅色漸變粉紅三氯化鐵反應(yīng)橙黃色二氯丙醇和乙酰氯反應(yīng)綠色第四十九頁(yè)，共127頁(yè)。2.比旋度鑒別維生素D2維生素D3溶劑

濃度比旋度值無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇40mg/ml5mg/ml+102.5°～+107.5°+105°～+112°注意事項(xiàng)：應(yīng)于容器開(kāi)啟30分鐘內(nèi)取樣，在溶液配制后30分鐘內(nèi)測(cè)定。第五十頁(yè)，共127頁(yè)。

3.區(qū)別反應(yīng)：以96%乙醇為溶劑，加乙醇和85%硫酸，D2顯紅色，在570nm處有最大吸收，D3顯黃色，在495nm處有最大吸收。

4.其他方法：

TLC、HPLC、制備衍生物測(cè)熔點(diǎn)

第五十一頁(yè)，共127頁(yè)。三、雜質(zhì)檢查維生素D2中麥角甾醇的檢查：加洋地黃皂苷溶液，混合，放置18h不得發(fā)生渾濁或沉淀。前維生素D的光照產(chǎn)物第五十二頁(yè)，共127頁(yè)。四、含量測(cè)定方法中國(guó)藥典（2000年版）采用正相高效液相色譜法測(cè)定維生素D的含量，定量方法為內(nèi)標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物為鄰苯二甲酸二甲酯，該法分為三個(gè)方法。

固定相：硅膠

流動(dòng)相：正己烷-正戊醇（997：3）第五十三頁(yè)，共127頁(yè)。第一法：用于無(wú)維生素A醇及其它雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：測(cè)定重復(fù)性和分離度。

第五十四頁(yè)，共127頁(yè)。

2．測(cè)定校正因子：

AS/mS

f1=--------

Ar/mr

f2=（ASmr-f1mSAr1）/（Ar1mS）

3．含量測(cè)定：

mi=（f1Ai1+f2Ai2）mS/AS第五十五頁(yè)，共127頁(yè)。第二法：用于有雜質(zhì)的干擾的情況，步驟如下：

1．皂化處理：皂化、乙醚提取、洗滌提取液、蒸除乙醚、制備供試液A。

2．凈化：供試液A經(jīng)液相色譜分離，準(zhǔn)確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液，制備成供試液B。

固定相：ODS

流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水（50：50：2）

3．含量測(cè)定：取供試液B按第一法測(cè)定。

第五十六頁(yè)，共127頁(yè)。第三法：用于經(jīng)第二法處理后仍有雜質(zhì)的干擾的情況。步驟如下：1．制備供試液：取供試液A，凈化，水浴加熱，得供試液C。

制備對(duì)照液：對(duì)照品儲(chǔ)備液：稀釋、加熱。

2．含量測(cè)定：在第一法的色譜條件下，交替精密進(jìn)樣對(duì)照液和供試液，按外標(biāo)法定量。返回第五十七頁(yè)，共127頁(yè)。苯并－二氫吡喃醇第三節(jié)維生素E

第五十八頁(yè)，共127頁(yè)。名稱R1R2相對(duì)活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***第五十九頁(yè)，共127頁(yè)。dl－α－生育酚醋酸酯第六十頁(yè)，共127頁(yè)。結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、苯環(huán)+二氫吡喃環(huán)+飽和烴鏈1、UV2、乙?；姆恿u基易水解]O[醌型化合物△生育酚-+orOHHVitE雜質(zhì)，需檢查第六十一頁(yè)，共127頁(yè)。]O[生育紅（一）硝酸反應(yīng)橙紅色鑒別二、75℃15′HNO3VitE生育酚第六十二頁(yè)，共127頁(yè)。（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑第六十三頁(yè)，共127頁(yè)。三氯化鐵－聯(lián)吡啶反應(yīng)（二）第六十四頁(yè)，共127頁(yè)。生育酚對(duì)-生育醌[O]弱氧化劑第六十五頁(yè)，共127頁(yè)。血紅色第六十六頁(yè)，共127頁(yè)。

=41.0～45.5λmax=284nmλmin=254nm0.01%無(wú)水乙醇中UV法（三）第六十七頁(yè)，共127頁(yè)。薄層板硅膠G展開(kāi)劑環(huán)己烷-乙醚（4：1）顯色劑硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7-生育酚Rf

=0.5-生育醌Rf

=0.9TLC法（四）第六十八頁(yè)，共127頁(yè)。2.游離生育酚

雜質(zhì)檢查

三、原理酸度

以NaOH滴定液（0.1mol/L）體積控制。第六十九頁(yè)，共127頁(yè)。（M生育酚=430.8）例

取本品0.10g，加無(wú)水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過(guò)1.0ml。第七十頁(yè)，共127頁(yè)?！?.15％限量第七十一頁(yè)，共127頁(yè)。四、含量測(cè)定GC法（法定方法）（一）GC特點(diǎn)1、選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)→衍生化易受樣品蒸氣壓限制第七十二頁(yè)，共127頁(yè)。載氣→N2固定液→硅酮（OV-17）擔(dān)體→硅藻土或高分子多孔小球柱溫→265℃檢測(cè)器→氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)內(nèi)標(biāo)→正三十二烷

n≥500R≥2VitE測(cè)定的色譜條件2、內(nèi)標(biāo)法加校正因子第七十三頁(yè)，共127頁(yè)。內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物對(duì)照液（對(duì)照+內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測(cè)組分峰靠近能與各組分完全分離與被測(cè)組分的量接近第七十四頁(yè)，共127頁(yè)。校正因子：第七十五頁(yè)，共127頁(yè)。WWKK%VitE%10012=稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)樣對(duì)實(shí)際工作中的計(jì)算方法××××第七十六頁(yè)，共127頁(yè)。（二）HPLC法外標(biāo)法此外，還有鈰量法、比色法和熒光法返回第七十七頁(yè)，共127頁(yè)。氨基嘧啶環(huán)－CH2－噻唑環(huán)(季銨堿)第四節(jié)維生素B1HClCl-第七十八頁(yè)，共127頁(yè)。（一）溶解性1、易溶于水2、水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵λmax=246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、第七十九頁(yè)，共127頁(yè)。與生物堿↓→↓（三）硫色素反應(yīng)（四）嘧啶環(huán)——噻唑環(huán)——（五）鹽酸根呈氯化物的反應(yīng)，用于鑒別。第八十頁(yè)，共127頁(yè)。ChP鑒別試驗(yàn)二、（一）硫色素反應(yīng)第八十一頁(yè)，共127頁(yè)。第八十二頁(yè)，共127頁(yè)。硫色素＋2H第八十三頁(yè)，共127頁(yè)。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)第八十四頁(yè)，共127頁(yè)。S元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)（三）其他反應(yīng)()21PbSNaSVitBNO3PbNaOH第八十五頁(yè)，共127頁(yè)。三、含量測(cè)定喹那啶紅－亞甲藍(lán)（紫紅→天藍(lán)）（一）非水溶液滴定法第八十六頁(yè)，共127頁(yè)。反應(yīng)摩爾比為1：2第八十七頁(yè)，共127頁(yè)。UV法（二）第八十八頁(yè)，共127頁(yè)。片劑、注射劑=421（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=A=ECL規(guī)格g/片g/100mlgChPWEA%cmD10011××%100標(biāo)示量平均片重××第八十九頁(yè)，共127頁(yè)。（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm100110011×標(biāo)示量稀釋倍數(shù)××第九十頁(yè)，共127頁(yè)。（三）硫色素?zé)晒夥ㄔ?、熒光硫色素異丁醇鐵氰化鉀1VitBNaOH第九十一頁(yè)，共127頁(yè)。特點(diǎn)2、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于體液分析第九十二頁(yè)，共127頁(yè)。第五節(jié)維生素CL－抗壞血酸第九十三頁(yè)，共127頁(yè)。1、易溶于水2、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）溶解性第九十四頁(yè)，共127頁(yè)。二烯醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)（二）還原性第九十五頁(yè)，共127頁(yè)。有活性有活性無(wú)活性第九十六頁(yè)，共127頁(yè)?！魈穷惖娘@色反應(yīng)50℃結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)第九十七頁(yè)，共127頁(yè)。C3－OH的pKa=4.17C2－OH的pKa=11.57酸性（四）一元酸第九十八頁(yè)，共127頁(yè)。L(+)－抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）（五）光學(xué)活性**第九十九頁(yè)，共127頁(yè)。與堿反應(yīng)（六）水解性第一百頁(yè)，共127頁(yè)。第一百零一頁(yè)，共127頁(yè)。與氧化劑的反應(yīng)（一）鑒別試驗(yàn)二、去氫抗壞血酸]O[VitC第一百零二頁(yè)，共127頁(yè)。1、與AgNO3反應(yīng)2、與2，6-二氯靛酚反應(yīng)(ChP2000)氧化型玫瑰紅色還原型藍(lán)色(ChP2000)第一百零三頁(yè)，共127頁(yè)。（玫瑰色）（無(wú)色）第一百零四頁(yè)，共127頁(yè)。3.其他氧化劑的反應(yīng)：亞甲藍(lán)或高錳酸鉀試劑褪色

堿性酒石酸銅磚紅色沉淀

磷鉬酸鉬藍(lán)

第一百零五頁(yè)，共127頁(yè)。糖類的反應(yīng)（二）或鹽酸50℃吡咯USP第一百零六頁(yè)，共127頁(yè)。第一百零七頁(yè)，共127頁(yè)。（藍(lán)色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)第一百零八頁(yè)，共127頁(yè)。UV（三）BP0.01mol/LHCl第一百零九頁(yè)，共127頁(yè)。三、雜質(zhì)檢查

1.溶液的澄清度與顏色：有色雜質(zhì)分光光度法

2.鐵、銅離子：原子吸收分光光度法第一百一十頁(yè)，共127頁(yè)。指示劑淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測(cè)定四、第一百一十一頁(yè)，共127頁(yè)。H+第一百一十二頁(yè)，共127頁(yè)。取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過(guò)的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6。方法2、第一百一十三頁(yè)，共127頁(yè)。（1）酸性環(huán)境d.HCl（2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論3、（3）立即滴定趕走水中O2減少O2的干擾第一百一十四頁(yè)，共127頁(yè)。（4）附加劑干擾的排除片劑——滑石粉——過(guò)濾注射劑——抗氧劑——丙酮甲醛Na2SO3NaHSO3

Na2S2O3Na2S2O5第一百一十五頁(yè)，共127頁(yè)。CHHOOaS3aSO+H2NHON2252HONHCOS3a第一百一十六頁(yè)，共127頁(yè)。2，6-二氯靛酚鈉滴定法法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，-62VitC第一百一十七頁(yè)，共127頁(yè)。自身指示終點(diǎn)法方法2、第一百一十八頁(yè)，共127頁(yè)。（2）快速滴定2min內(nèi)（1）酸性環(huán)境HPO3-HAc穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測(cè)定（定量過(guò)量）（測(cè)剩余染料）討論3、第一百一十九頁(yè)，共127頁(yè)。（4）缺點(diǎn)

需經(jīng)常標(biāo)定貯存≤一周不穩(wěn)定干擾多氧化力較強(qiáng)第一百二十頁(yè)，共127頁(yè)。

公元前3500年-古埃及人發(fā)現(xiàn)能防治夜盲癥的物質(zhì)，也就是后來(lái)的維A。

1600年-醫(yī)生鼓勵(lì)以多吃動(dòng)物肝臟來(lái)治夜盲癥。

1747年-蘇格蘭醫(yī)生林德發(fā)現(xiàn)檸檬能治壞血病，也就是后來(lái)的維C。

1831年-胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)。

1905年-甲狀腺腫大被碘治愈。

1911年-波蘭化學(xué)家豐克為維生素命名。

1915年-科學(xué)家認(rèn)為糙皮病是由于缺乏某種維生素而造成的