茄子ISSR和SSR分子標(biāo)記的鑒定技術(shù)分析

茄子ISSR和SSR分子標(biāo)記的鑒定技術(shù)分析陳兆貴;雷玲玲;鄭曉宇;龔玲【摘要】以茄子為研究對(duì)象，初步建立起茄子的ISSR和SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，包括DNA提取、退火溫度、循環(huán)次數(shù)和引物篩選等.結(jié)果表明,ISSR分子標(biāo)記體系中,從49條引物中篩選出3個(gè)條帶清晰的引物對(duì)6個(gè)品種進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出26條帶,其中多態(tài)性帶21條多態(tài)性比例為80.77%;SSR分子標(biāo)記體系中從4對(duì)引物中篩選出3個(gè)條帶清晰的引物對(duì)6個(gè)品種進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)出17條帶,其中多態(tài)性帶5條，多態(tài)性比例為29.41%,2種方法均能把6個(gè)茄子品種區(qū)分開來，本實(shí)驗(yàn)為茄子品種鑒定和新品種選育提供理論依據(jù).【期刊名稱】《種子》【年(卷)，期】2014(033)004【總頁(yè)數(shù)】6頁(yè)(P29-34)【關(guān)鍵詞】茄子;ISSR;SSR;分子標(biāo)記【作者】陳兆貴;雷玲玲;鄭曉宇;龔玲【作者單位】惠州學(xué)院生命科學(xué)系廣東惠州516007;湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128;惠州市惠城區(qū)菜籃子工程科學(xué)技術(shù)研究所廣東惠州I516023;惠州市惠城區(qū)菜籃子工程科學(xué)技術(shù)研究所廣東惠州516023【正文語種】中文【中圖分類】S641.1茄(Solanummelongena)屬茄科茄屬非塊莖組，多年生小灌木狀草本植物，原產(chǎn)于印度次大陸，印度可能是其起源中心［1］，中國(guó)和日本是茄子的第二起源中心［2］，15世紀(jì)阿拉伯人把茄子引入西方。世界各地茄子育種工作者先后開展了RFLP(RestrictiOnfragmentlengthpolymorph-ism,Bostein)［3］、RAPD(RandomamplifiedPolymorphicDNA)［4,5］、AFLP(AmPlifiedfragmentlengthpolymorphiSm)［6］等技術(shù)的應(yīng)用，并在揭示野生種和栽培種的特點(diǎn)、遺傳多樣性和品種間的親緣關(guān)系鑒定等方面取得了重要成果。分子標(biāo)記是一種新的分子水平上的遺傳標(biāo)記，已廣泛用于農(nóng)作物種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析［7］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物DNA序列由于進(jìn)化速率上的差異而被廣泛應(yīng)用于不同物種種間及種內(nèi)的鑒別［8］。以茄子為研究對(duì)象，初步建立起茄子的ISSR和SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系，為茄子的品種保護(hù)和新品種選育提供參考。實(shí)驗(yàn)選用的6個(gè)茄子品種分別為紫美人長(zhǎng)茄、雙艷二號(hào)紫紅長(zhǎng)茄、輝煌一號(hào)、單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄、連引一號(hào)、惠寶從紫紅茄，種子均由廣東省惠州市惠城區(qū)菜籃子工程研究所提供，干燥保存?zhèn)溆?。?個(gè)茄子品種各取10粒種子分別放在培養(yǎng)皿中遮光發(fā)芽，7d后長(zhǎng)出黃化苗，用CTAB法［9］(略有改動(dòng))進(jìn)行DNA的提取，并用紫外分光度法測(cè)定DNA純度。分別對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。退火溫度的優(yōu)化：選用809引物，以連引一號(hào)為模板，退火溫度分別為45°C、46.9C、48.6C、51.3C、52.9C、53.7C、55C、56C,循環(huán)次數(shù)35次，進(jìn)行溫度梯度實(shí)驗(yàn)。循環(huán)次數(shù)的優(yōu)化：選用809,842,855,864,866引物(表1),模板為連引—號(hào)，利用優(yōu)化好的退火溫度，設(shè)計(jì)循環(huán)次數(shù)為35、40、45次3個(gè)梯度進(jìn)行優(yōu)化，選出較適合的循環(huán)次數(shù)。PCR擴(kuò)增體系：PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀中進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇以下反體系：25"的PCR反應(yīng)體系（含模板DNA約1”,Taq酶0.5pL,dNTPs1pL,引物1pL,10xbuffer2pL,ddH2O15pL;PCR擴(kuò)增條件：94°C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行45次循環(huán)（94^變性1min,54^復(fù)性1min,72C延伸1min）,721延伸8min,16CForever。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖電泳，紫外檢測(cè)拍照。（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法：對(duì)ISSR電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，以DGL2000Maker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶按有（1）或無（0）進(jìn)行人工統(tǒng)計(jì)，在收集過程中，只記錄清晰的帶，模糊不清的帶不記。用NTSYS-pc2.10e軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，然后用UPGA法構(gòu)建聚類樹狀圖。試驗(yàn)備選引物為Nunome等［10］公開發(fā)表的茄子SSR標(biāo)記引物，本試驗(yàn)從中選取的擴(kuò)增片段在200bp以上的多態(tài)性標(biāo)記4對(duì)進(jìn)行引物篩選，序列信息如表2所示。引物由大連寶生物公司合成。PCR擴(kuò)增體系：PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200型熱循環(huán)儀中進(jìn)行，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，最終選擇以下反應(yīng)體系：25pL的PCR反應(yīng)體系（含模板DNA約1pL,Taq酶0.5pL,dNTPs1pL,引物1pL,10xbuffer2pL,ddH2O15pL;PCR擴(kuò)增條件:94C預(yù)變性5min，然后進(jìn)行45次循環(huán)（941變性1min,541復(fù)性1min,72C延伸1min）,72C延伸8min,16CForever。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（表3）、銀染檢測(cè)。將提取的DNA樣品進(jìn)行電泳擴(kuò)增和紫外檢測(cè)。電泳結(jié)果表明，用CTAB法提取的DNA質(zhì)量較好（圖1）。用1.2%的水平凝膠電泳檢測(cè)，采用改良后的CTAB法提取的DNA樣品在水平凝膠電泳上得到了清晰、穩(wěn)定的條帶，沒有太大程度的降解，可應(yīng)用于ISSR-PCR體系和SSR-PCR體系擴(kuò)增。說明改良后的CTAB法可以有效地應(yīng)用于茄子基因組DNA的提取。為了研究不同循環(huán)次數(shù)對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，設(shè)置不同的循環(huán)次數(shù)系列試驗(yàn),共設(shè)置35、40次和45次循環(huán)的不同試驗(yàn)，結(jié)果表明:循環(huán)次45次時(shí)，擴(kuò)增效果較好，因此最終選擇45次循環(huán)擴(kuò)增(圖2)。為研究不同退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響，設(shè)置不同的退火溫度系列，試驗(yàn)結(jié)果表明：擴(kuò)增退火溫度較低時(shí)，產(chǎn)出的雜帶多，背景較淺，當(dāng)退火溫度升高時(shí)，擴(kuò)增特異性升高，背景較深。而退火溫度再度升高，條帶背景變得較淺。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最終確定引物809、842、855的最佳退火溫度為55°C,引物864、866的最佳退火溫度為54C。對(duì)ISSR電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，以NMW002marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶進(jìn)行人工統(tǒng)計(jì)。收集過程中清晰的條帶記為(1),無或模糊不清的條帶記為(0)。結(jié)果顯示(表4):引物809出帶11條，其中特異性帶9條；引物842出帶7條，其中特異性帶5條；引物864出帶8條，其中特異性帶7條；3條引物總共出帶26條，其中特異性帶21條，特異性帶比例為80.77%(圖4),說明ISSR標(biāo)記在茄子基因組中能揭示較多的信息。SSR-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化主要對(duì)退火溫度的進(jìn)行優(yōu)化。以單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄為模板，設(shè)置53C、54C、55C、55.9C、58.5C、62.1C、65C、66.8C、68C9種退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)其擴(kuò)增條帶的亮度。最終確定引物130、A21、D09最適退火溫度為55C,引物48的最適退火溫度為68C。圖5為SSR引物A21的退火溫度。對(duì)SSR電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，以NMW002marker為分子量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶進(jìn)行人工統(tǒng)計(jì)。其中引物48無多態(tài)性。收集過程中清晰的條帶記為(1),無或模糊不清的條帶記為(0)。ISSR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，采用NTSYS-PC2.10e.軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，然后用UPGA法構(gòu)建聚類樹狀圖。結(jié)果表明，6個(gè)茄子品種可以聚為兩類：即紫美人長(zhǎng)茄、雙艷二號(hào)紫紅長(zhǎng)茄、輝煌一號(hào)、連引一號(hào)、惠寶紫紅長(zhǎng)茄聚為一類，而單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄單獨(dú)為一類。其中第一類中連引一號(hào)和惠寶紫紅長(zhǎng)茄親緣關(guān)系最近，紫美人長(zhǎng)茄與其他品種的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。SSR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)1、0數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后，采用NTSYS-PC2.10e.軟件進(jìn)行遺傳相似性系數(shù)計(jì)算，然后用UPGA法構(gòu)建聚類樹狀圖。結(jié)果表明，6個(gè)茄子品種可以聚為兩類：即紫美人長(zhǎng)茄、雙艷二號(hào)紫紅長(zhǎng)茄、惠寶紫紅長(zhǎng)茄聚為一類，其中紫美人長(zhǎng)茄與惠寶紫紅長(zhǎng)茄親緣關(guān)系較密切，雙艷二號(hào)紫紅長(zhǎng)茄親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)；而輝煌—號(hào)、連引一號(hào)、單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄聚為一類，其中連引一號(hào)和單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄長(zhǎng)茄、輝煌一號(hào)和雜交一號(hào)親緣關(guān)系較為親近。ISSR分子標(biāo)記是在SSR的3'或5'端錨定1~4個(gè)堿基作引物，對(duì)兩側(cè)具有反向排列SSR的一段序列進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、技術(shù)要求低、成本低廉、可以采用與常規(guī)PCR相同的反應(yīng)條件等優(yōu)點(diǎn)，而且與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性高［11］。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)也存在一些不足，例如其大部分為顯性標(biāo)記，不能區(qū)分純合體與雜合體，而且對(duì)于顯性標(biāo)記，進(jìn)行兩倍體或多倍體物種的種群多樣性研究時(shí)，目前還沒有一種十分合適的數(shù)學(xué)模型來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析［12］。此外，ISSR雖然已經(jīng)廣泛用于植物種質(zhì)資源鑒定的研究，但是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)的DNA指紋圖譜庫(kù)，尚不能大規(guī)模廣泛應(yīng)用于作物品種真實(shí)性和純度鑒定。相信隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn)，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)憑借其簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)將得到廣泛使用，特別是應(yīng)用于大批量樣品的研究，為植物種質(zhì)資源研究發(fā)揮更大的作用［13］。SSR標(biāo)記技術(shù)具有大量的等位變異，所揭示的多態(tài)性十分豐富，信息量大，重復(fù)性好而且穩(wěn)定可靠，在動(dòng)植物的構(gòu)建分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜、種質(zhì)資源評(píng)估、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、品種真實(shí)性和種子純度鑒定等領(lǐng)域的研究都有很好的應(yīng)用價(jià)值，并且在人類基因診斷和預(yù)測(cè)方面也有比較重要的作用［14,15］。雖然SSR分子標(biāo)記有以上諸多優(yōu)點(diǎn)，但它一般需要建立篩選基因組文庫(kù)、克隆測(cè)序、引物設(shè)計(jì)等一系列實(shí)驗(yàn)。SSR引物必須依賴測(cè)序設(shè)計(jì)引物，人力、物力消耗巨大，且SSR標(biāo)記中所使用的引物不同，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。在進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用時(shí)，須首先克隆微衛(wèi)星位點(diǎn)，得到微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列以設(shè)計(jì)引物，這給微衛(wèi)星標(biāo)記的應(yīng)用帶來了一定的困難，隨著可利用的成品微衛(wèi)星序列引物對(duì)會(huì)越來越多，SSR標(biāo)記技術(shù)將會(huì)得到逐步完善，并將成為一種簡(jiǎn)便、快捷、高效的分子標(biāo)記分析手段，在動(dòng)植物和人類疾病研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用［16,17］。試驗(yàn)采用ISSR和SSR2種分子標(biāo)記方法分別對(duì)供試的6個(gè)茄子材料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：ISSR和SSR均可將供試的6個(gè)茄子材料分開。而對(duì)于茄子品種間的相似性問題，根據(jù)聚類圖看，由于2種分子標(biāo)記的原理不同，所揭示的基因組的范圍也不同，因而得出了不同的遺傳相似性系數(shù)，由此產(chǎn)生的聚類圖雖相似卻不完全一致。對(duì)比ISSR和SSR分子標(biāo)記的聚類圖發(fā)現(xiàn)，2種標(biāo)記都把紫美人長(zhǎng)茄、雙艷二號(hào)紫紅長(zhǎng)茄、惠寶紫紅長(zhǎng)茄聚為一簇，說明這些品種間親緣關(guān)系較近，而單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄為另一簇，說明單艷一號(hào)紫紅長(zhǎng)茄與上述3種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，2種標(biāo)記方法對(duì)這些品種間親緣關(guān)系的鑒定可靠性高。然而，2種標(biāo)記方法之間也存在一定的差異性。產(chǎn)生差異的主要原因是：(1)ISSR標(biāo)記和SSR標(biāo)記所檢測(cè)的基因座位范圍不同，ISSR標(biāo)記檢測(cè)的是重復(fù)序列間的片段；而SSR標(biāo)記檢測(cè)的是特異保守區(qū)；(2)與兩種標(biāo)記所使用的引物有關(guān)，ISSR引物是15-24個(gè)堿基的重復(fù)錨定引物，不同的引物檢測(cè)得到的多態(tài)性不一樣，而且多態(tài)性片段數(shù)隨著引物數(shù)量的增加而增加，必然引起遺傳距離的變化；SSR引物是以1-6個(gè)核苷酸為單位，多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列。這種序列在真核生物的基因組中廣泛存在，通過PCR進(jìn)行分析。SSR的側(cè)翼序列被認(rèn)為在種內(nèi)是保守的，有時(shí)在屬間，甚至在科內(nèi)屬間也是保守的，所以根據(jù)側(cè)翼序列可以設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增SSR位點(diǎn)的引物；(3)可能與所用SSR引物數(shù)較少，本實(shí)驗(yàn)只有4對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，只有3對(duì)引物能擴(kuò)增出DNA帶，由于所用的SSR的引物較少，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也有一定的影響；(4)部分品種DNA的降解現(xiàn)象也對(duì)遺傳圖譜的生成產(chǎn)生移動(dòng)影響，還需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。當(dāng)今茄子分子遺傳育種雖然進(jìn)展很快，但總的來說還處在摸索期，不足主要表現(xiàn)在:(1)目標(biāo)基因的標(biāo)記和育種工作往往分開進(jìn)行，造成兩項(xiàng)工作無法很好銜接;(2)遺傳圖譜是分子標(biāo)記輔助育種的基礎(chǔ)，茄子遺傳圖譜的飽和度仍需進(jìn)一步增加，而且功能基因特別是有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的數(shù)量性狀標(biāo)記相對(duì)偏少;(3)準(zhǔn)確的基因克隆能為創(chuàng)造具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因植物提供先決條件，而茄子的基因克隆還有待突破;(4)茄子的二倍體野生種研究較多，四倍體栽培種研究卻相對(duì)較少，需進(jìn)一步加強(qiáng)。【相關(guān)文獻(xiàn)】Gleddie，S.，Keller,W，Setterfield，etal.In:Evans,D,A.,SharpW,R,(Eds.),HandbookofPlantCellCulture,v01.3.TechniquesforPropagationandBreeding.MacMillan,NewYork,PP,1986:500-511.Gleddie,S.,Keller,W.,Setterfield,G.ProductionandcharacterizationofsomatichybridsbetweenSolanummelongenaL.andS.SisymbriifoliumLain[J].Theoret.Appl,Genet,1986(71):613-621.LITT,M.,J.A.LUTY.AhypervariablemicrosatelliterevealedbyInvitoramplificationofadinucleotiderepeatwithinthecardiacmus2cleactingene[J].Am.J.Hum.Genet.,1989(44):397-401.TAUTZ,D.,M.TRICK,G.A.DOVER.CrypticsimplicityinDNAisamajorsourceofgeneticvariation[J].Nature,1986,322:652-656.伍玲，楊恩年.幾個(gè)抗穗發(fā)芽小麥品種的SSlR標(biāo)記多態(tài)性[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2003,16(1):16-21.邱英雄，傅承新，孔航輝.楊梅不同品種的ISSR分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2002,10(4):343-346.孫洪，程靜，詹克慧，等.ISSR標(biāo)記技術(shù)及其在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2005,3(1):123-127.黃瓊林，楊錦芬，段中崗，等.基于26SrDNAD1-D3區(qū)和matK基因序列分析的陽(yáng)春砂分子鑒定[J]廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010,27(2):151-155.朱英，陶剛，劉作易，等.普遍適有于農(nóng)作物基因組DNA的提取方法及值得注意的幾個(gè)問題[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005,33(5):20-21.NunomeT,NegoroS,KonoI,etal.DevelopmentofSS