抗體制備技術(shù)

抗體制備技術(shù)第1頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五引言概念抗體(antibody,Ab)是B細(xì)胞識(shí)別抗原后，增殖、分化為漿細(xì)胞所產(chǎn)生的一種蛋白質(zhì)，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。2第2頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五引言結(jié)構(gòu)與類別3第3頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五引言應(yīng)用領(lǐng)域4第4頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五引言人工抗體制備多克隆抗體（免疫血清）單克隆抗體基因工程抗體5第5頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五引言高質(zhì)量的抗體應(yīng)該具有高效價(jià)、高特異性及高親和性。制備高質(zhì)量抗體就必須有理想的免疫原，適宜的動(dòng)物和制定最佳的免疫方案。6第6頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備免疫原問題一：多克隆抗體制備第7頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五何謂免疫原？免疫原（immunogen)指用于制備抗體的抗原(antigen)或半抗原(hapten）；免疫原包括顆粒性抗原、可溶性抗原和人工修飾的抗原；8第8頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備顆粒性免疫原顆粒性免疫原包括：細(xì)胞性抗原：血細(xì)胞和組織細(xì)胞病原體：細(xì)菌、病毒、支原體等9第9頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備綿羊紅細(xì)胞采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調(diào)合適濃度10第10頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備細(xì)菌性免疫原培養(yǎng)細(xì)菌分離、鑒定離心、洗滌合適濃度擴(kuò)大培養(yǎng)滅活處理11第11頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備可溶性免疫原組織勻漿破碎細(xì)胞提純目的蛋白酶消化處理超聲粉碎反復(fù)凍融12第12頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備可溶性免疫原提純目的蛋白選擇性沉淀凝膠層析離子交換層析親和層析13第13頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備可溶性免疫原層析技術(shù)層析柱紫外監(jiān)測(cè)收集器14第14頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備可溶性免疫原免疫原的鑒定純度蛋白含量免疫活性分子量15第15頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原人工免疫原經(jīng)過人工修飾的半抗原稱之為人工免疫原。如：甾體類激素、小分子藥物等。將半抗原與蛋白載體連接，使之具有免疫原性，可用于制備免疫血清。16第16頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原用于連接的載體蛋白質(zhì)類：白蛋白多肽聚合物：多聚賴氨酸大分子聚合物：羧甲基纖維素常用：BSA，OA17第17頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原修飾半抗原是需考慮：半抗原的溶解度和穩(wěn)定性;結(jié)合鍵的位置;選擇適合的偶聯(lián)試劑；18第18頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原含有氨基或羧基的半抗原與載體連接方法：碳化二亞胺法混合酸酐法戊二醛法形成穩(wěn)定肽鍵19第19頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原不含有氨基或羧基的半抗原需改造成帶有上述基團(tuán)的衍生物，再通過上述方式連接：琥珀酸酐法可將帶有羥基的半抗原改造成帶羧基的半抗原。20第20頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備人工免疫原一般情況下：人工免疫原的制備是一個(gè)重要和復(fù)雜的工作；一種半抗原需同時(shí)連接兩種不同載體，便于半抗原抗體的檢測(cè)；21第21頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五關(guān)于佐劑的使用何謂“佐劑”佐劑（adjuvant）是指能夠增強(qiáng)免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)，應(yīng)用時(shí)可與抗原同時(shí)或預(yù)先注射于機(jī)體。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒有免疫原性。22第22頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五關(guān)于佐劑的使用佐劑種類：具有免疫原性抗酸桿菌（BCG）無免疫原性福氏佐劑氫氧化鋁常用：福氏佐劑23第23頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五福氏佐劑成分：羊毛脂液體石蠟BCG不完全佐劑完全佐劑24第24頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五福氏佐劑使用原則：顆粒性抗原一般情況下不需使用；可溶性大分子量的蛋白質(zhì)免疫原、人工抗原，初次免疫時(shí)必須使用佐劑；不連續(xù)兩次使用完全福氏佐劑，以免導(dǎo)致動(dòng)物嚴(yán)重反應(yīng)；25第25頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備福氏佐劑-可溶性抗原復(fù)合物可溶性抗原福氏佐劑充分乳化研磨法與注射器混合法26第26頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五選擇動(dòng)物與免疫動(dòng)物問題一:免疫血清的制備第27頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五免疫血清與多克隆抗體28第28頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備免疫血清的程序獲得理想免疫原選擇免疫動(dòng)物確定免疫方案實(shí)施免疫程序檢測(cè)抗體效價(jià)采血分離血清抗體純化鑒定29第29頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五如何選擇免疫動(dòng)物原則：免疫原與動(dòng)物種屬關(guān)系；動(dòng)物個(gè)體狀況的選擇；抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類；抗血清用量和要求；30第30頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五如何選擇免疫動(dòng)物家兔是最常用的免疫動(dòng)物山羊、綿羊馬、駱駝31第31頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五動(dòng)物飼養(yǎng)做好標(biāo)記細(xì)心觀察做好記錄精心喂養(yǎng)32第32頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五免疫方案免疫原用量免疫途徑次數(shù)與間隔時(shí)間33第33頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五免疫方案之一：全量免疫法足掌皮下接種福氏完全佐劑-抗原（l～10mg）背部皮下接種福氏不完全佐劑-抗原（l～10mg），并重復(fù)3-4次，間隔1周肌肉、腹腔或靜脈加強(qiáng)免疫（l～10mg）1周1周34第34頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五免疫方案之二：微量免疫法足掌皮下接種BCG（10～20mg）腘窩淋巴結(jié)注射福氏完全佐劑-抗原（0.1～0.2mg）肌肉或靜脈加強(qiáng)免疫（0.4～0.6mg）1周1周35第35頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五如何測(cè)定抗體效價(jià)顆粒性抗原免疫原性強(qiáng)，抗體效價(jià)高，可采用凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定?？扇苄钥乖捎贸恋矸磻?yīng)或其它標(biāo)記免疫技術(shù)測(cè)定。36第36頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五如何測(cè)定抗體效價(jià)ELISA是常用技術(shù)之一37第37頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備單克隆抗體的理論基礎(chǔ)問題二:單克隆抗體制備第38頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五克隆選擇學(xué)說1857年，F(xiàn)MBurnet提出克隆選擇學(xué)說。指出：每個(gè)B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體只識(shí)別一種抗原表位，并產(chǎn)生針對(duì)該決定簇的抗體。39第39頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五克隆選擇學(xué)說40第40頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五克隆選擇學(xué)說淋巴細(xì)胞不能在體外長期存活41第41頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五雜交瘤技術(shù)雜交瘤細(xì)胞繼承兩個(gè)親本細(xì)胞特性42第42頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五雜交瘤技術(shù)的創(chuàng)始人43第43頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五雜交瘤技術(shù)1984榮獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)雜交瘤技術(shù)是制備抗體的技術(shù)革命44第44頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五雜交瘤技術(shù)的基本原理問題二:單克隆抗體制備第45頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五兩個(gè)基本問題選擇親本細(xì)胞與細(xì)胞融合應(yīng)用選擇培基與雜交瘤細(xì)胞篩選46第46頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五親本細(xì)胞之一：免疫脾細(xì)胞被抗原致敏的B淋巴細(xì)胞，可分化為漿細(xì)胞并分泌免疫球蛋白；單一B細(xì)胞克隆表達(dá)一種抗原受體，識(shí)別并結(jié)合一種抗原表位，分泌單一特異性抗體；47第47頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五親本細(xì)胞之一：免疫脾細(xì)胞采用BALB/c小鼠48第48頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五親本細(xì)胞之二：骨髓瘤細(xì)胞選擇有HGPRT或TK缺陷的細(xì)胞株；能與B細(xì)胞雜交形成穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，并分泌免疫球蛋白；骨髓瘤細(xì)胞本身不分泌免疫球蛋白；具有較高融合效率；49第49頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五親本細(xì)胞之二：骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞NS1細(xì)胞容易培養(yǎng)傳代，一般培養(yǎng)基即可，無特殊要求。50第50頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五親本細(xì)胞之二：骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0為懸浮型細(xì)胞51第51頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合52第52頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合化學(xué)法物理法生物法PEG（聚乙二醇）為最常用的融合法53第53頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五選擇培養(yǎng)基基本成分次黃嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）HAT選擇培養(yǎng)基54第54頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五選擇培養(yǎng)基作用原理為何使用選擇培養(yǎng)基？55第55頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五選擇培養(yǎng)基作用原理56第56頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五選擇培養(yǎng)基作用原理57第57頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五雜交瘤技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程問題二:單克隆抗體制備第58頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)流程59第59頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)流程60第60頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)流程制備免疫脾細(xì)胞培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合克隆篩選克隆化細(xì)胞鑒定大量制備61第61頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五技術(shù)要點(diǎn)免疫脾細(xì)胞的制備骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與篩選細(xì)胞融合陽性克隆的篩選克隆化大量抗體的制備62第62頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備脾細(xì)胞選擇合適的免疫方案是獲得高質(zhì)量的抗體的前提；一般要在融合前兩個(gè)月左右確立免疫方案開始初次免疫；免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定；

63第63頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五制備脾細(xì)胞64第64頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞SP2/0細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞，易發(fā)生突變喪失酶的缺陷；為確保SP2/0細(xì)胞對(duì)HAT的敏感性，每3～6月應(yīng)用8-AG(8氮鳥嘌呤)篩選一次，以防止細(xì)胞的突變；65第65頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞+8-AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells66第66頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五培養(yǎng)篩選骨髓瘤細(xì)胞使用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，融合前進(jìn)行換液，確保細(xì)胞處于最佳狀態(tài)。培基：RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10～20％。一般在準(zhǔn)備融合前的兩周就應(yīng)開始復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞。67第67頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合FUSIONPEGMYELOMACELLSSPLEENCELLSHYBRIDOMACELLSELISAPLATEFeederCellsGrowthMediumHATMediumPlatingofCellsinHATselectiveMediumScanningofViableHybridomas68第68頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)中最為關(guān)鍵一步；融合前親本細(xì)胞需經(jīng)預(yù)處理；融合37℃水浴中進(jìn)行；注意兩種親本細(xì)胞的比例；選擇高質(zhì)量細(xì)胞融合劑；緩慢終止融合作用；69第69頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五關(guān)于“PEG”分子量1500-3000道爾頓；誘導(dǎo)細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細(xì)胞膜易打開而有助于細(xì)胞融合；不同廠商、批號(hào)、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同；應(yīng)用濃度為50%；70第70頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五挑選陽性克隆細(xì)胞生長至一定數(shù)量后便可進(jìn)行；方法應(yīng)敏感、簡(jiǎn)單、重復(fù)性好；方法：

RIA、ELISA、FIA；71第71頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五挑選陽性克隆ELISA是常用技術(shù)之一72第72頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五克隆化將陽性克隆與其它克隆分開的過程?？寺』瘧?yīng)及早進(jìn)行，以防止陽性克隆丟失。方法有：顯微操作法有限稀釋法軟瓊脂法

73第73頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行克隆化不需任何特殊設(shè)備克隆出現(xiàn)效率高實(shí)驗(yàn)室常用方法74第74頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五細(xì)胞鑒定特異性Ig類與亞類中和活性染色體核型識(shí)別抗原表位親和力75第75頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五大量制備抗體體外細(xì)胞培養(yǎng)腹腔內(nèi)培養(yǎng)76第76頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五大量制備抗體腹腔內(nèi)培養(yǎng)77第77頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)流程體外細(xì)胞培養(yǎng)78第78頁，共90頁，2023年，2月20日，星期五實(shí)驗(yàn)流程注意：陽性細(xì)胞克隆的凍存與復(fù)