細(xì)菌培養(yǎng)基的制備、滅菌及接種、培養(yǎng)技術(shù)

第一部分

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備、滅菌目的要求實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)程序1現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二目的要求熟悉玻璃器皿的洗滌和滅菌前的準(zhǔn)備。掌握培養(yǎng)基和無菌水的制備方法。掌握高壓蒸氣滅菌技術(shù)。2現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)材料藥品：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、蒸餾水等。高壓蒸氣滅菌鍋、烘箱、細(xì)菌過濾器、酒精燈。其它：培養(yǎng)皿、試管、移液管、錐形瓶、燒杯、玻璃珠等。3現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序玻璃器皿的洗滌和包裝培養(yǎng)基的制備無菌稀釋水的制備培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌4現(xiàn)在是4頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1（玻璃器皿的洗滌和包裝）清洗并烘干玻璃器皿：如培養(yǎng)皿、移液管、試管等。棉塞的制作包裝培養(yǎng)皿和移液管等。

5現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（培養(yǎng)基的種類）據(jù)組成成分可分為:

1.合成培養(yǎng)基：由各種純化學(xué)物質(zhì)按一定比例配制而成。2.半合成培養(yǎng)基：有一部分純化學(xué)物質(zhì)和另一部分天然物質(zhì)配制而成。3.天然培養(yǎng)基：利用天然來源的有機(jī)物配制而成。從培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可分為1.液體培養(yǎng)基：不加凝固劑的液體狀態(tài)培養(yǎng)基。2.固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入15～30g/L左右的瓊脂。3.半固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基中加入3～5g/L左右的瓊脂。6現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（培養(yǎng)基的種類）常用凝固劑為瓊脂（其次為明膠），又叫洋菜、凍粉。7現(xiàn)在是7頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）1.取一個(gè)300mL燒杯，裝150mL蒸餾水。2.按配方逐一正確稱取各種成分，依次加入水中溶解。注意：a.前一種成分溶解之后，才能加入下一種成分b.可加熱促進(jìn)各成分溶解c.加熱過程應(yīng)不斷攪拌，以免糊底燒焦，并適當(dāng)補(bǔ)充因蒸發(fā)而損失的水量。培養(yǎng)基配方牛肉膏蛋白胨氯化鈉瓊脂蒸餾水pH數(shù)量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.68現(xiàn)在是8頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）3.調(diào)pH值：用10％NaOH調(diào)pH至7.6，用精密pH試紙對(duì)照。4.分裝：將培養(yǎng)基分裝于5支試管，其余全部倒入250mL錐形瓶中，分別塞上棉塞。注意不要污染棉塞和瓶口。5.包扎成捆，掛上標(biāo)簽，注明何種培養(yǎng)基。6.滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在37℃下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長(zhǎng)，方可使用。9現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2（培養(yǎng)基的分裝和斜面培養(yǎng)基的制作）☆每支試管裝的量為試管高度的1/4～1/3.☆斜面長(zhǎng)度為試管長(zhǎng)度的1/3～1/2.10現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2（培養(yǎng)基的配制方法和步驟）11現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序3

（無菌稀釋水的制備）取一個(gè)250mL的錐形瓶裝90(或99)mL蒸餾水，放30顆玻璃珠(用于打破活性污泥、菌塊或土壤顆粒)于錐形瓶?jī)?nèi)，塞棉塞、包扎，待滅菌。另取5支18mm×180mm的試管，分別裝9mL蒸餾水，塞棉塞、包扎，待滅菌。無菌稀釋水為微生物分離實(shí)驗(yàn)中所需要的材料。12現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序4

（培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌）加熱滅菌有干熱滅菌和濕熱滅菌。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器干熱滅菌的操作方法a.將待滅菌的物品放入恒溫箱，將溫度調(diào)節(jié)至160℃并維持2h；b.把恒溫箱的調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)回零處，待溫度降到50℃左右，才能將物品取出。13現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序4

（培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌）濕熱滅菌：高壓蒸氣滅菌法高壓蒸氣滅菌法的操作步驟如下：1.滅菌鍋內(nèi)加入一定量的水。2.將待滅菌的物品放入鍋內(nèi)，并關(guān)嚴(yán)鍋蓋。

注意：器物不能裝得太滿。3.接通電源，進(jìn)行加熱。4.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待溫度計(jì)指示溫度為100℃時(shí)關(guān)閉排氣閥；或當(dāng)排出的蒸氣相當(dāng)猛烈且微帶藍(lán)色時(shí)關(guān)閉排氣閥。14現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序4

（培養(yǎng)基和玻璃器材等的滅菌）5.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2(滅菌器內(nèi)的溫度為121℃)即開始滅菌，使其維持15～30min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力(0.56kg/cm2)，延長(zhǎng)時(shí)間。6.滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品，排出鍋內(nèi)剩余水。7.待培養(yǎng)基冷卻后置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，若無菌生長(zhǎng)則放入冰箱或陰涼處保存?zhèn)溆谩?5現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二16現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序4（培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法）間歇滅菌法：即常壓滅菌，用于一些受高溫而破壞的培養(yǎng)基的滅菌。操作方法：a.待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次在100℃煮沸30～60min，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。b.在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。c.第三次蒸煮之后基本無菌，但為了確保無菌仍要放在37℃恒溫條件下培養(yǎng)24h，確定無菌才能使用。17現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序4

（培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法）過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。18現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二第二部分

細(xì)菌純種分離、培養(yǎng)和接種技術(shù)目的要求實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)程序19現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二目的要求掌握從環(huán)境中分離培養(yǎng)細(xì)菌的方法，從而獲得若干種細(xì)菌純培養(yǎng)技能。掌握幾種接種技術(shù)。20現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)材料無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)10套、無菌移液管1mL2支、10mL1支。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基1瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，無菌稀釋水90mL1瓶、9mL5管。其它：接種環(huán)、酒精燈、恒溫箱。21現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序細(xì)菌的純種分離細(xì)菌的接種方法22現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1（細(xì)菌的純種分離）稀釋平板法平板劃線法23現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——稀釋平板法）1.

取樣。

2.將1瓶90mL和5管9mL無菌水排列好，用記號(hào)筆依次編上10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL水樣(或其它樣品)加入編號(hào)為10－1無菌水(內(nèi)含玻璃珠)中，將移液管吹洗三次，用手搖10min將顆粒狀樣品打散。即為10－1濃度的菌液。用1mL無菌移液管吸取1mL10－1濃度的菌液于編號(hào)為10－2無菌水中，將移液管吹洗三次，搖勻即為10－2濃度菌液。同樣方法，依次稀釋到10－6。24現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——稀釋平板法）稀釋液的制備25現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作①取10套無菌培養(yǎng)皿編號(hào)，10－4、10－5、10－6各3個(gè)，另一個(gè)為空氣對(duì)照。②取1支1mL無菌移液管從濃度小的菌液開始，以10－6、10－5、10－4為序分別吸取0.5mL菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)(每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻)。26現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作③加熱培養(yǎng)基，當(dāng)其冷至45℃左右時(shí)，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時(shí)針和逆時(shí)針來回轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。27現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——稀釋平板法）3.

平板的制作④取對(duì)照無菌培養(yǎng)皿，倒平板待凝固后，打開皿蓋10min后蓋上，倒置于30℃培養(yǎng)24～48h，然后觀察結(jié)果。28現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——平板劃線法）1.平板制作：將融化并冷至約50℃的肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成平板。2.劃線：用接種環(huán)挑取一環(huán)樣品，左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線(切勿劃破培養(yǎng)基)。劃線完畢蓋好皿蓋，30℃培養(yǎng)24～48h后觀察結(jié)果。29現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序1

（細(xì)菌的純種分離——平板劃線法）30現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（細(xì)菌的接種技術(shù)）接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。圖－631現(xiàn)在是31頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（細(xì)菌的接種技術(shù)——斜面接種法）①左手平托兩支試管，拇指壓住兩支試管。外側(cè)是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接種的空白斜面(兩支試管的斜面同時(shí)向上)。右手將棉塞旋松，以便在接種時(shí)容易拔出。②右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。③將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指、無名指和手掌將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍?shī)A在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。12332現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有34頁(yè)\編輯于星期二實(shí)驗(yàn)程序2

（細(xì)菌的接種技術(shù)——斜面接種法）④將已灼燒過的接種環(huán)伸入菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出并迅速伸入待接種試管底部，在斜面上由底部向上劃線。抽出接種環(huán)，塞上棉塞將試管插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。4567833