細(xì)胞生物學(xué)教程第十三章細(xì)胞周期課件

CELLCYCLE第十三章細(xì)胞增殖是生命的基本特征，種族繁衍、個體發(fā)育、機體修復(fù)等都離不開細(xì)胞增殖。初生嬰兒有1012個細(xì)胞，成人1014個，約200種類型。成人體內(nèi)每秒鐘有數(shù)百萬新細(xì)胞產(chǎn)生，以補償衰老和死亡的細(xì)胞。一個大腸桿菌若按20分鐘分裂一次，并保持這一速度，則兩天即可超過地球的重量。第一節(jié)基本概念EucaryoticCellCycle

Atypicalmammaliancellhasacellcycletimeof24hours,with12hrG1,6-8hrS,3-4hrG2,and1hrM從增殖的角度來看，可將高等動物的細(xì)胞分為三類：①連續(xù)分裂細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞。②休眠細(xì)胞暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は驴芍匦逻M入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。③不分裂細(xì)胞，指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形核細(xì)胞等細(xì)胞周期的時間長短與物種的細(xì)胞類型有關(guān)。通常G1期持續(xù)時間差異較大，M期最短約0.5～4.5小時。標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentagelabeledmitoses，PLM）：對測定細(xì)胞進行脈沖標(biāo)記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過統(tǒng)計標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TDR。二、細(xì)胞周期時間的測定細(xì)胞同步化(synchronization)是指在自然過程中發(fā)生或經(jīng)人為處理造成的細(xì)胞周期同步化。（一）自然同步化1、多核體：如：粘菌、瘧原蟲。2、某些水生動物的受精卵：如海膽、海參、兩棲類。3、增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入適宜環(huán)境后，它們一起發(fā)芽，同步分裂。三、細(xì)胞同步化1、選擇同步化1）有絲分裂選擇法：M期細(xì)胞與培養(yǎng)皿的附著性低，振蕩脫離器壁收集。優(yōu)點：操作簡單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。缺點：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少（分裂細(xì)胞約占1%～2%）。2）細(xì)胞沉降分離法：M期細(xì)胞體積大，可用離心分離。優(yōu)點：可用于任何懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞。缺點：同步化程度較低。（二）人工同步化2、誘導(dǎo)同步化1）DNA合成阻斷法：選用DNA合成的抑制劑，可逆地抑制DNA合成。常用TDR雙阻斷法：在細(xì)胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)基中加入過量TDR（Hela2mol/L；CHO7.5mol/L）。S期細(xì)胞被抑制，停在G1/S交界處。移去TDR，釋放時間大于TS時，再次加入過量TDR。優(yōu)點：同步化程度高缺點：產(chǎn)生非均衡生長，個別細(xì)胞體積增大。2）中期阻斷法用秋水仙素等細(xì)胞分裂抑制劑將細(xì)胞阻斷在中期。優(yōu)點是無非均衡生長現(xiàn)象，缺點是可逆性較差。一、細(xì)胞分裂的類型無絲分裂(amitosis)：又稱直接分裂，由Remark（1841）發(fā)現(xiàn)于雞胚血細(xì)胞，不涉及紡錘體形成及染色體變化。有絲分裂(mitosis)：又稱為間接分裂，由Fleming(1882)年首次發(fā)現(xiàn)于動物，Strasburger(1880)發(fā)現(xiàn)于植物。減數(shù)分裂(meiosis）：染色體復(fù)制一次，細(xì)胞連續(xù)分裂兩次。二、有絲分裂為了便于描述人為的劃分為六個時期：間期（interphase）；前期(prophase)；前中期(premetaphase)；中期(metaphase)；后期(anaphase)；末期(telophase)。其中間期包括G1期、S期和G2期，主要進行DNA復(fù)制、中心體復(fù)制、細(xì)胞體積增大等準(zhǔn)備工作。（一）前期①染色質(zhì)凝縮，②分裂極確立與紡錘體開始形成，③核仁解體，④核膜消失。Twocentrosomes,andtheirformingradialarraysofastralmicrotubulesseparatingonthesurfaceofanearlyprophasenewtlungcellnucleus.圖片來自圖片來自（二）前中期核膜解體到染色體排列到赤道面(equatorialplane)上。（四）后期指妹妹染色體單體分開并移向兩極的時期。分為后期A、后期B兩個過程。AnaphaseA:separationofthesisterchromatids.AnaphaseB:separationofthepoles.植物細(xì)胞有沒有后期B？（五）末期從子染色體到達(dá)兩極，至形成兩個新細(xì)胞為止的時期。涉及子核的形成和胞質(zhì)分裂兩個方面。末期子核的形成，大體經(jīng)歷了與前期相反的過程，即染色體解聚縮，核仁出現(xiàn)和核膜重新形成。核纖肽B去磷酸化，介導(dǎo)核膜重新裝配。核分裂與胞質(zhì)分裂（cytokinesis）是相繼發(fā)生的，屬于兩個分離的過程，如：大多數(shù)昆蟲的卵，核可進行多次分裂而無胞質(zhì)分裂，某些藻類的多核細(xì)胞可長達(dá)數(shù)尺，以后胞質(zhì)才分裂形成單核細(xì)胞。子核的形成與胞質(zhì)分裂植物細(xì)胞末期近兩極處紡錘絲消失，中間微管保留，并數(shù)量增加，形成成膜體。來自高爾基體囊泡沿微管轉(zhuǎn)運到成膜體中間。融合形成細(xì)胞板(cellplate)，囊泡的內(nèi)含物形成初生壁和中膠層，囊泡膜形成質(zhì)膜，融合留下的管道形成胞間連絲。第三節(jié)減數(shù)分裂Meiosis由連續(xù)兩次分裂構(gòu)成：通常減數(shù)分裂I分離的是同源染色體，所以稱為異型分裂（heterotypicdivision）或減數(shù)分裂（reductionaldivision）。減數(shù)分裂II分離的是姊妹染色體，類似于有絲分裂，所以稱為同型分裂（homotypicdivision）或均等分裂（equationaldivision）。為了描述方便將減數(shù)分裂分為幾個期和亞期。MeiosisConcepts:GameticmeiosisSporicmeiosisZygoticmeiosis稱前減數(shù)分裂間期或前減數(shù)分裂期(premeiosis)。間期也可分為G1期、S期和G2期。G2期是有絲分裂向減數(shù)分裂轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵時期。減數(shù)分裂的S期時間較長，部分DNA（約0.3%左右）是在合線期合成的。一、間期二、分裂期（一）減數(shù)分裂I1、前期I減數(shù)分裂的特殊過程主要發(fā)生在前期I，通常分為5個時期：①細(xì)線期（leptotene），②合線期（zygotene），③粗線期（pachytene），④雙線期（diplotene），⑤終變期（diakinesis）。1）細(xì)線期：染色體呈細(xì)線狀，具有念珠狀的染色粒。2）合線期：亦稱偶線期，是同源染色體配對的時期。概念：聯(lián)會復(fù)合體(synaptonemalcomplex，SC）二價體（bivalent）四分體（tetrad）。這一時期合成約0.3%左右的DNA，稱為Z-DNA。3）粗線期：同源染色體的非姊妹染色單體間發(fā)生交換的時期。4）雙線期：聯(lián)會的同源染色體相互排斥、開始分離，交叉開始端化(terminalization)。聯(lián)會復(fù)合體消失。補充：植物細(xì)胞雙線期一般較短，許多動物卵細(xì)胞中雙線期停留的時間非常長。人的卵母細(xì)胞在五個月胎兒中已達(dá)雙線期，而一直到排卵都停在雙線期，排卵年齡大約在12-50歲之間。魚類、兩棲類、爬行類、鳥類以及無脊椎動物的昆蟲中，雙線期的二階體解螺旋而形成燈刷染色體，這一時期是卵黃積累的時期。5）終變期：二階體顯著變短。由于交叉端化過程的進一步發(fā)展，故交叉數(shù)目減少，通常只有一至二個交叉。核仁此時開始消失，核被膜解體。2、中期I3、后期I二價體的兩條同源染色體分開，分別向兩極移動。同源染色體隨機分向兩極，染色體重組，人類染色體重組概率有223個。4、末期I5、減數(shù)分裂間期。（二）減數(shù)分裂II可分為前、中、后、末四個四期，與有絲分裂相似。一個精母細(xì)胞形成4個精子；一個卵母細(xì)胞形成一個卵子及2-3個極體。Chromosomerecombination1Chromosomerecombination2Minimumnumberofgametetypes=2n,Inhumans,n=23SC由兩條同源染色體沿縱軸形成，外觀呈梯子狀。SC幫助交換的完成，SC上有重組節(jié)(recombinationnodules)，是交換發(fā)生的部位。SC主要由堿性蛋白質(zhì)和RNA組成，并含有少量DNA。SC形成合線期，成熟于粗線期，消失于雙線期。在細(xì)線期或合線期加入DNA合成抑制劑，則抑制SC的形成。三、聯(lián)會復(fù)合體synaptonemalcomplex第四節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控一、研究背景1970sRao和Johnson發(fā)現(xiàn)與M期細(xì)胞(Hela)融合的間期細(xì)胞染色體發(fā)生凝縮，稱為早熟凝集染色體(prematurelycondensedchromosome，PCC)。G1期PCC為單線狀，因DNA未復(fù)制。S期PCC為粉末狀，因DNA由多個部位開始復(fù)制。G2期PCC為雙線染色體，說明DNA復(fù)制已完成。甚至不同類的M期細(xì)胞也可誘導(dǎo)PCC產(chǎn)生，說明M期細(xì)胞具有促進間期細(xì)胞進行分裂的因子，即成熟促進因子(maturationpromotingfactor，MPF)。PCC1960sLeland

Hartwell,1970sPaulNurse以芽殖酵母和裂殖酵母為實驗材料，利用溫度敏感突變株，發(fā)現(xiàn)許多與細(xì)胞分裂有關(guān)的基因(celldivisioncyclegene,CDC)。如：裂殖酵母cdc2、芽殖酵母cdc28突變型在限制溫度下無法分裂；wee1突變型則提早分裂，cdc25突變型細(xì)胞體積增大而不分裂；cdc2和cdc28都編碼一個34KD的蛋白激酶，促進細(xì)胞周期的進行，weel和cdc25分別表現(xiàn)為抑制和促進CDC2的活性。Fissionyeast

buddingyeast

Cdc25&Wee1mutant1980sTimothyHunt發(fā)現(xiàn)海膽的卵裂過程中兩種蛋白質(zhì)的含量隨細(xì)胞周期振蕩，命名為周期蛋白(cyclinA和B)。后來發(fā)現(xiàn)各類動物來源的細(xì)胞周期蛋白mRNA均能誘導(dǎo)蛙卵的成熟。1988年Lohka將非洲爪蟾的MPF純化。經(jīng)鑒定MPF由32KD和45KD兩種蛋白組成，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。進一步的研究發(fā)現(xiàn)MPF=CDC2+clyclinBLelandH.Hartwell

R.Timothy(Tim)Hunt

SirPaulM.Nurse

2001年10月8日美國人Leland

Hartwell、英國人PaulNurse、Timothy

Hunt因?qū)?xì)胞周期調(diào)控機理的研究而獲諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。二、CDKCDC2與細(xì)胞周期蛋白結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)。CDC2又被稱為CDK1，可將特定蛋白磷酸化，促進細(xì)胞周期運行，又稱作細(xì)胞周期引擎。如將核纖層蛋白磷酸化導(dǎo)致核纖層解體、核膜消失；將H1磷酸化導(dǎo)致染色體的凝縮等。在動物中已知7種CDK。均含有一段相似的激酶結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域有一段保守序列，即PSTAIRE，與周期蛋白的結(jié)合有關(guān)。三、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子CDKinhibitor,

CKI對細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：①Ink4(Inhibitorofcdk4):P16ink4a,P15ink4b,P18ink4c,P19ink4d。特異性抑制cdk4·cyclinD1,cdk6·cyclinD1。②Kip(Kinaseinhibitionprotein)：P21cip1(cyclininhibitionprotein1）P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21cip1還能與DNA聚合酶δ的輔助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）結(jié)合，直接抑制DNA的合成。四、細(xì)胞周期蛋白cyclin特點：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。含有一段約100個氨基酸的保守序列，稱為周期蛋白框，介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。作用：激活CDK，引導(dǎo)CDK作用于不同底物。已知30余種，在脊椎動物中為A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分為4類：G1型、G1/S型、S型、M型。不同類型的CDK/cyclin復(fù)合體*包括D1-3，各亞型cyclinD在不同細(xì)胞中的表達(dá)量不同，但具有相同的功效。G1期，在生長因子的刺激下，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。G1-S期，cyclinE與CDK2結(jié)合，促進細(xì)胞進入S期。CyclinE的抗體能使細(xì)胞停滯于G1期。在G2-M期，cyclinA、cyclinB與CDK1結(jié)合，CDK1使底物蛋白磷酸化、如將組蛋白H1磷酸化導(dǎo)致染色體凝縮，核纖層蛋白磷酸化使核膜解體。cellcycleregulation在中期當(dāng)MPF活性達(dá)到最高時，激活后期促進因子APC，將泛素連接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶體(proteasome)降解，完成一個細(xì)胞周期。分裂期周期蛋白N端有一段序列與其降解有關(guān)，稱降解盒(destructionbox)。泛素由76個氨基酸組成，高度保守。共價結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑。26S蛋白酶體是一個大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。DestructionBoxinCyclinsM期CDK的激活起始于分裂期cyclin的積累。結(jié)合cyclinB的CDK1被Wee1將Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不斷積累。在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障礙。CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDKactivatingkinaseCAK)的作用下完成的。五、M期CDK的激活CDKactivating組成：感受器、信號傳導(dǎo)通路、效應(yīng)器。