生物技術(shù)第二講植物組培的培養(yǎng)基課件

第二講培養(yǎng)基目的要求：一、掌握培養(yǎng)基的種類及其特點(diǎn)三、掌握培養(yǎng)基的組成和其適宜劑量二、掌握MS培養(yǎng)基配制四、理解培養(yǎng)基篩選方法

第一節(jié)培養(yǎng)基的種類和成分

一、培養(yǎng)基種類▼二、培養(yǎng)基成分▼

第二節(jié)培養(yǎng)基制備

▼一、母液配制和保存二、培養(yǎng)基配制、分裝和滅菌▼第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇▼一、單因子試驗(yàn)二、多因子試驗(yàn)三、逐步增減法四、廣譜實(shí)驗(yàn)法

培養(yǎng)基種類

固體培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基▲營(yíng)養(yǎng)分布均勻，生長(zhǎng)整齊一致，但通氣性差。通氣性較好，便于操作，但營(yíng)養(yǎng)分布不均，生長(zhǎng)發(fā)育不整齊。二者比較2、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)基分為：

初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基

外植體：從植物體上取出的用于無(wú)菌培養(yǎng)的植物材料。

植物材料：莖尖、莖段、花瓣、葉子、花藥等

初代培養(yǎng)：指用來(lái)第一次接種從植物體上分離下來(lái)的外植體過(guò)程。繼代培養(yǎng)：對(duì)培養(yǎng)物(包括細(xì)胞、組織或其切段)通過(guò)更換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進(jìn)行連續(xù)多代的培養(yǎng)，就稱為繼代培養(yǎng)。

常用培養(yǎng)基種類

MS培養(yǎng)基

B5培養(yǎng)基White培養(yǎng)基

N6培養(yǎng)基KM-8P培養(yǎng)基

★有機(jī)成分復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素

用于原生質(zhì)體培養(yǎng)(包括原生質(zhì)融合的培養(yǎng))KM-8P培養(yǎng)基特點(diǎn)：N6培養(yǎng)基特點(diǎn)：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)成分簡(jiǎn)單KNO3

和(NH4)2SO4含量高廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其它植物的花藥培養(yǎng)等

B5培養(yǎng)基特點(diǎn)：含較低的銨雙子葉植物尤其木本植物組培可選擇

MS培養(yǎng)基特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽、離子濃度高，硝酸鹽含量較高。

▲MS培養(yǎng)基是目前應(yīng)用最多最普遍的培養(yǎng)基。無(wú)機(jī)鹽的濃度較高，能保證組織培生長(zhǎng)所需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)。并且因?yàn)殡x子濃度高，在配制、貯存、消毒過(guò)程中，即使有些成分略有出入，也不致影響培養(yǎng)基中的離子平衡

二、

培養(yǎng)基成分

水

植物激素

無(wú)機(jī)鹽

有機(jī)物培養(yǎng)體支持材料

輔助性物質(zhì)▲二、有機(jī)物維生素肌醇氨基酸天然復(fù)合物椰子汁（CM）酵母浸出液（YE)水解酪蛋白（CH)碳水化合物馬鈴薯汁液其它▲碳水化合物選用種類：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等蔗糖濃度：2%～3%，胚培養(yǎng)為4%～15%大生產(chǎn)時(shí)可用白糖▲

糖在培養(yǎng)基的作用：1）為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架2）為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量3）維持滲透壓

氨基酸：甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等等。因培養(yǎng)基的種類不同，其種類和濃度不同。肌醇：又稱環(huán)己六醇，在糖類的轉(zhuǎn)化中起作用

名稱分子量溶解性質(zhì)性質(zhì)蔗糖342.30溶于水、乙醇無(wú)變旋現(xiàn)象山梨糖180.16溶于水甜味與蔗糖相似葡萄糖180.16溶于水有變旋現(xiàn)象，以游離態(tài)或磷酯形式存在果糖180.16溶于水、乙醇有變旋現(xiàn)象，甜度高于蔗糖鹽酸硫胺素（VB1）337.28溶于水、乙醇、甘油受高溫影響小，可高溫消毒核黃素（VB2）376.37溶于無(wú)水乙醇、微溶于水等電點(diǎn)PH=6.0，堿性溶液中易變質(zhì)，光能加速變質(zhì)鹽酸吡哆素（VB6）205.64溶于水、乙醇對(duì)光、空氣、熱穩(wěn)定是轉(zhuǎn)氨酶的輔酶鈷胺素（VB12）1355.42溶于水、乙醇受高溫影響小，可高溫消毒，參與絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼徇^(guò)程煙酸（VPP）123.11極易溶于水、乙醇對(duì)空氣、光、熱、PH值穩(wěn)定生物素（VH）244.31溶于水、乙醇對(duì)空氣溫度穩(wěn)定葉酸（VM）441.40易溶于乙酸、NaOH、微溶于水參與生物甲基化作用抗壞血酸（VC）176.12極易溶于水有較強(qiáng)的還原能力，可做抗氧化劑用，參與酪氨酸代謝及色氨酸的羥基化作用肌醇180.16易溶于水植物中廣泛存在，可能與IAA的代謝有關(guān)常見(jiàn)糖和維生素及其主要性質(zhì)椰乳：促愈傷組織和細(xì)胞培養(yǎng)，用量10－20%，使用注意莖尖大小香蕉泥：用量150－200ml/L，應(yīng)用在蘭花組培馬鈴薯汁液：用量150－200g/L，使苗壯水解酪蛋白：濃度100－200mg/L，應(yīng)用在微莖尖培養(yǎng)天然復(fù)合物▲（一）、激素的種類：1、生長(zhǎng)素類：在自然界中，生長(zhǎng)素影響莖和節(jié)間的伸長(zhǎng)、向性、頂端優(yōu)勢(shì)、葉片脫落和生根等現(xiàn)象

在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織）

組織培養(yǎng)中常用的生長(zhǎng)素：

1二氯苯氧乙酸（2，4－D）

2萘乙酸（NAA）3吲哚乙酸（IAA）

4吲哚－－3－丁酸（IBA）NAA、IAA、IBA被廣泛用于生根，2，4－D有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。

IAA容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時(shí)間不要太久。

溶解方法：1MNaOH或95％酒精，以前者為好保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存4、脫落酸在自然界中，脫落酸能阻礙發(fā)育、促進(jìn)老化、形成休眠芽等作用。

經(jīng)試驗(yàn)表明，脫落酸有利于胚性愈傷組織形成正常不定芽。

材料的試管保存，加上脫落酸能抑制生長(zhǎng)，使繼代培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)。溶解：易溶于NaHCO3溶液、氯仿或丙酮。保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存（二）、常見(jiàn)培養(yǎng)基中植物激素配方類型激素配方再生方式及用途1.無(wú)植物激素誘導(dǎo)生根、無(wú)性胚、愈傷組織形成2.單加生長(zhǎng)素誘導(dǎo)生根、愈傷組織、無(wú)性胚、不定芽3.單加細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖、愈傷組織形成4.高生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)芽、原球莖增殖、愈傷組織形成5.低生長(zhǎng)素高細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)叢芽、愈傷組織形成6.低生長(zhǎng)素低細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽、側(cè)芽增殖7.等量生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)側(cè)芽增殖8.加生長(zhǎng)抑制劑（多效唑、矮壯素等）壯苗、延緩生長(zhǎng)、利于試管苗保存9.加GA3打破種子、芽休眠，促進(jìn)伸長(zhǎng)生長(zhǎng)名稱分子量溶解性質(zhì)主要作用吲哚乙酸（IAA）175.19易溶于熱水、乙醇、乙醚、丙酮促進(jìn)細(xì)胞的延伸生長(zhǎng)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松馳，也可用于誘導(dǎo)生根吲哚丁酸(IBA)203.24溶于醇、丙酮、醚稀堿、稀酸液為生根刺激劑

a-萘乙酸(NAA)186.20易溶于熱水、丙酮、醚、乙酸、稀堿液促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，刺激生根2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)221.04易溶于醇、丙酮、乙醇、稀堿液促進(jìn)愈傷組織形成赤霉酸(GA3)346.38易溶于醇、乙酸乙酯、碳酸氫鈉和醋酸鈉的水溶液，其鈉促進(jìn)莖、葉伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，打破休眠（三）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及主要性能一覽表（四）、常見(jiàn)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的微摩爾/升濃度與毫克/升的換微摩爾/升毫克/升IAAIBANAA2,4-DKTBA2iPZTTDZGA310.1750.20320.18620.22100.21520.22530.20270.21900.22020.346420.35040.40640.37240.44210.43040.45050.40540.43800.44040.692730.52550.60940.55860.66310.64560.67580.60810.65700.66061.039140.70070.81280.74480.88420.86080.90100.81080.87600.88081.385550.87591.01600.93101.10521.07611.12631.01351.09501.10101.731961.05111.21921.11721.32621.29131.35161.21621.31401.32122.078271.22631.42241.30341.54731.50651.57681.41891.53301.54142.424681.40141.62561.48961.76831.72171.80211.62161.75201.76162.771091.57661.82881.67581.98941.93692.02731.82431.97101.98183.1173四、培養(yǎng)體支持材料1.瓊脂用量7－10g/L（0.7%-1%）注意：1若濃度過(guò)高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)就難于擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中。

2當(dāng)進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)需要研究時(shí)，應(yīng)注意不要使用瓊脂，因?yàn)槭袌?chǎng)供應(yīng)所有瓊脂含有雜質(zhì)，特別是含有Ca,Mg和微量元素。2.其它

卡拉膠、玻璃纖維、濾紙橋、海綿等▲五、輔助性物質(zhì)1.抗生素2.抗氧化物3.活性炭▲

抗生素1.常用種類：青霉素鏈霉素慶大霉素等2.用量：5%－20%3.作用：防止由外植體內(nèi)生菌造成的污染。4過(guò)濾滅菌

▲

抗氧化物

常用抗氧化劑及使用：

半胱氨酸VC（50－200mg/L液洗滌外植體傷口表面）?；钚蕴?/p>

1.作用：具吸附作用；莖尖初代培養(yǎng)可防褐化；促進(jìn)新梢增殖（濃度0.1－0.2%）；促進(jìn)生根；防止組培苗玻璃化（濃度0.3%）。利于胚胎培養(yǎng)。2.常用濃度：0.5－10g/L3.活性炭的作用

①對(duì)生長(zhǎng)的抑制：其吸附了植物激素②對(duì)生長(zhǎng)的刺激：其吸附了有抑制作用的物質(zhì)▲

第二節(jié)培養(yǎng)基配制一、母液配制與保存二、培養(yǎng)基配制(一)母液配制流程圖

稱量

母液分裝確定培養(yǎng)基

溶解

定容

貼標(biāo)簽保存于冰箱一、母液配制(以MS為例)

稱量藥品

天平預(yù)置全顯示清零稱藥(二)母液配制要求：1.母液濃縮倍數(shù)：10-100，大量元素10；微量元素、鐵鹽100；有機(jī)物50；2.選用蒸餾水、重蒸餾水、分析純或化學(xué)純?cè)噭?.防止沉淀4.激素母液濃度：1mg/ml,1次配成50或100ml5.激素溶解：IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于熱水或95%酒精再加水；2，4-D先溶于1MNaOH再加水；

KT、BA先溶于1MHCl再加水。

為什么要配制母液？1）方便2）準(zhǔn)確（有些成分量太?。?）母液要分類配，否則有些成分混合一起會(huì)產(chǎn)生沉淀以MS培養(yǎng)基為例：MS培養(yǎng)基母液的配制母液保存：在冰箱內(nèi)

低溫保存二、培養(yǎng)基配制移母液調(diào)PH值培養(yǎng)基熬制滅菌稱取蔗糖、瓊脂扎口定容分裝二次定容接種確定配方

大量元素母液

微量元素母液

鐵鹽母液

有機(jī)物母液

取100ml取10ml取10ml取10ml注：MS培養(yǎng)基配制容量瓶要求：一次性移取，不能吸進(jìn)吸氣球里，數(shù)量看準(zhǔn)，不滴不漏，吹凈為度。移母液用自來(lái)水定容至1升定容：稱取蔗糖、瓊脂用自來(lái)水定容到1升取蔗糖25－30g，瓊脂7－8g。培養(yǎng)基熬制：3.將容量瓶中剩余的液體一并倒入鋁鍋中，搖晃使均勻。1.將定容好的培養(yǎng)液取1/3倒入鋁鍋中，同時(shí)加入稱好的蔗糖和瓊脂，邊煮邊攪拌，防止糊底。2.用旺火煮開(kāi)，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化。用0.1MNaOH或HCl調(diào)PH值為6.0。調(diào)PH值：分裝：趁熱分裝，100ml的三角瓶約裝入30－40ml。扎口與滅菌:要求封口松緊適宜，系活扣，便于接種操作。培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌，防止變質(zhì)。

滅菌后，應(yīng)盡快地轉(zhuǎn)移培養(yǎng)瓶使其冷卻，一般應(yīng)將滅菌后的培養(yǎng)基儲(chǔ)藏于30℃以下的室內(nèi)名，最好儲(chǔ)藏在4－10℃的條件下。應(yīng)當(dāng)注意的是，某些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)如IAA、ZT、ABA等以及某些維生素是不穩(wěn)定的，不能和其他的培養(yǎng)基一起高壓滅菌，而要進(jìn)行過(guò)濾滅菌。第三節(jié)培養(yǎng)基的選擇一、單因子試驗(yàn)二、多因子試驗(yàn)三、逐步增減法四、廣譜試驗(yàn)法2種激素5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合Ⅰ6－BA（mg/L)A1A2A3A4A5NAA（mg/L)B1B2B4B3B5B1A1B1A2B1A3B1A4B1A5B2A1B2A2B2A3B2A4B2A5B3A1B3A2B3A3B3A4B3A5B4A1B4A2B4A3B4A4B4A5B5A1B5A2B5A3B5A4B5A52種激素3種濃度的實(shí)驗(yàn)組合ⅡNAA（mg/L)6－BA（mg/L)低中高

低中高低低低中低高中低中中中高高低高中高高廣譜試驗(yàn)法

1把培養(yǎng)基分為4個(gè)大類：無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2對(duì)每一類物質(zhì)再選定3個(gè)