熒光定量PCR課件

實時熒光定量PCR

RealTimeQuantitativePCR內(nèi)容miRNA的特點及檢測熒光定量PCR檢測microRNAmicroRNA的來源miRNA前體與成熟體靶點識別–不嚴格互補配對一個miRNA可調(diào)節(jié)多個基因一個基因可受多個miRNA調(diào)控60%人類蛋白基因受miRNA調(diào)控miRNAsiRNAmiRNA與siRNA的異同miRNA檢測與定量經(jīng)典方法:放射標記Northern雜交miRNA芯片–基因表達譜

基本原理：某物種全部已知miRNA集中于一張芯片，點雜交檢測各miRNA豐度所回答的問題：哪些miRNA是你所應(yīng)該關(guān)注的優(yōu)點：高通量，全景觀察缺點：敏感度、特異性均有限，適用于初篩需后續(xù)驗證：熒光定量PCRPre-miRNA檢測必要性：不排除miRNA從前體到成熟體，從核內(nèi)轉(zhuǎn)運到核外的過程中存在調(diào)控機制的可能。SpecificmiRNAquantificationby

realtimePCR–waytogo關(guān)鍵難點豐度低解決辦法:小RNA提取太短解決辦法:加長序列高度相似miRNA之間難以區(qū)分解決辦法:特殊設(shè)計的檢測方法；小心設(shè)計引物與反應(yīng)優(yōu)化解決miRNA豐度難題

基本原理影響RNA分子與硅膠柱結(jié)合的因素離液劑chaotropicagent，如鹽酸胍離子強度，如NaCl

小分子有機溶劑，如乙醇精心調(diào)整各組份配比，達成大、小RNA與硅膠柱結(jié)合的區(qū)分條件，分離去除大分子量RNA，富集小分子量RNA小RNA提取

成熟miRNAqPCR檢測

-Poly(A)加尾法優(yōu)點：簡單直接，高效。一次逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA可用于多個目標分子的檢測。成熟miRNAqPCR檢測–莖環(huán)法優(yōu)點：特異引物逆轉(zhuǎn)錄，理論上效率更高，檢測更靈敏缺點：莖環(huán)引物設(shè)計復(fù)雜；特異引物逆轉(zhuǎn)錄不便多基因檢測檢測方法選擇依樣本特性，檢測目標多寡而定康為技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗舉例：復(fù)旦大學(xué)某客戶miRNA芯片提示10個miRNA在病人與正常人之間有顯著差異表達要求從66個外周血RNA樣本中檢測這10個miRNA加尾法，5個目標獲得良好檢測莖環(huán)法，4個目標獲得良好檢測1個目標的檢測很難，嘗試多種引物設(shè)計，調(diào)整反應(yīng)體系康為miRNA檢測服務(wù)

全套miRNA檢測：從生物樣本到數(shù)據(jù)莖環(huán)法miRNA檢測引物：定制(RealtimeQuantitativePCR)miRNA的特點及檢測熒光定量PCR檢測內(nèi)容

PCR：

偉大的天才發(fā)明UseofLSDSynthesisandself-testingofnovelpsychoactivesubstancesBeliefinastrology擴增曲線--Ct值：模板DNA量越多，熒光強度達到檢測域值所需的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。確定模板初始數(shù)量？

Real-timePCR:

檢測原理非特異性熒光標記：

SYBRGreenI特異性熒光標記：水解探針：

TaqMan非水解探針：Molecularbeacon

RQReporterQuencherRQ

染料法與探針法對比探針法特異性高--與探針與特異靶序列結(jié)合對模板有選擇性--可進行多重PCR反應(yīng)成本高--不同靶基因需要合成不同探針

染料法通用性好--對DNA模板沒有選擇性使用方便，成本低--僅需設(shè)計兩個引物有假陽性現(xiàn)象--通過融解曲線判斷Real-timePCR

應(yīng)用基因表達分析--相對定量：基因表達量的差異--絕對定量：樣本中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）基因型分析--SNP檢測等位基因檢測甲基化檢測

基因表達分析檢測

testsample處理樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因totalRNAcDNAcalibratorsample對照樣本targetgene目的基因referencegene內(nèi)參基因qPCR以各自樣本中內(nèi)參基因為標桿，比較兩樣本中目的基因的相對豐度。數(shù)據(jù)分析qPCRcDNAtotalRNA

內(nèi)參基因的選擇

特點選擇內(nèi)參基因內(nèi)參基因beta-actin、GAPDH、18SrRNA、28SrRNA等--文獻檢索--實驗篩選選擇多個備選內(nèi)參基因，以備選內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)作為均一化標準

內(nèi)參基因HousekeepingGene--RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同，用于定量分析的樣本初始濃度不同。對樣本初始濃度差異進行均一化校正。不同環(huán)境，不同器官、組織、細胞類型之間，表達量相對恒定。HousekeepingGene

康為產(chǎn)品不同豐度：高豐度

ACTB、GAPDH中等豐度

beta2M低豐度

HPRT1不同物種：人、大鼠、小鼠、豬、牛、羊、雞、斑馬魚、甘蔗等基因表達分析檢測樣本處理與RNA提取–cDNA–qPCR內(nèi)參基因(housekeepinggene)選擇樣本處理與RNA提取外界刺激

–

10分鐘

–

可檢測的表達改變樣品離開定義環(huán)境–

2分鐘內(nèi)

–固定、裂解細胞RNA樣本保存液Trizol超純RNA提取試劑盒RNA的評價與鑒定

-完整性-純度小心DNA污染！-使用DNaseⅠ-引物設(shè)計-以RNA作PCR陰性對照

CW0580

CW0592

CW0581

CW2090A

RT-qPCR一步法還是兩步法？兩步法：步驟多但靈活多樣。cDNA可長期保留，檢測多個基因，便于反應(yīng)條件的優(yōu)化。

推薦：工作的初期階段，以及單個樣本多個靶基因檢測。一步法：簡單、靈敏度高，有效減少實驗操作誤差和污染。每次只能做一個基因。

推薦：工作的成熟階段，以及多個樣本單個靶基因檢測。

逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄引物選擇下游應(yīng)用：是否檢測其它基因？AbundantRNA的干擾：mRNAortotalRNA？檢測靈敏度是否足夠？逆轉(zhuǎn)錄酶SuperRT逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）HiFi-MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（RNaseH-）

CW0741

CW0743總原則與普通PCR相同：避免引物二聚體，避免二級結(jié)構(gòu)擴增片段長度（80–300bp)推薦做跨intron設(shè)計引物設(shè)計原則EXON1EXON2INTRON2DNAEXON1EXON2RNA反應(yīng)條件優(yōu)化內(nèi)參基因–目的基因

--融解曲線：單一特異性產(chǎn)物--擴增曲線：Ct值--標準曲線：擴增效率盡量高，目的基因盡可能接近內(nèi)參基因反應(yīng)條件優(yōu)化融解曲線分析--單一特異性產(chǎn)物

將溫度對熒光強度的變化求導(dǎo)標準曲線分析--擴增效率盡量高--目的基因盡可能接近內(nèi)參基因

10%以內(nèi)反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化擴增曲線分析--Ct值MasterMix的應(yīng)用--熱啟動酶化學(xué)修飾，常溫下完全沒有聚合酶活性，熱復(fù)活需95℃10分鐘

--GoldStar、HotStar非化學(xué)修飾（Oligo修飾、抗體修飾、Mg2+螯合物）熱復(fù)活僅需95℃幾十秒--FastStar--Buffer反應(yīng)增強劑

--減少引物二聚體，進一步提高反應(yīng)特異性

--對于復(fù)雜模板，提高反應(yīng)效率穩(wěn)定劑--dNTPMasterMix的應(yīng)用ROXPassiveReference不參與、不干擾PCR反應(yīng)恒定發(fā)射熒光信號用于校正因信號檢測器到各孔間光路不同而導(dǎo)致的系統(tǒng)誤差。需參照儀器要求選擇。

誤差控制使用Mastermix配置預(yù)混體系設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同個體）技術(shù)性重復(fù)（復(fù)孔）陰性對照

熒光定量PCR體系2-ΔΔCt法滿足條件：1）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率接近-正負10%2）內(nèi)參基因和目標基因的擴增效率基本為90%-110%

相對定量數(shù)據(jù)分析1、目標基因的CT值-內(nèi)參基因的CT值2、待測樣本的ΔCT值-對照樣本的ΔCT值3、計算表達水平比率：2–ΔΔCT=表達量的比值Troubleshooting

熒光定量產(chǎn)品--染料法FastSYBRMixtureUltraSYBRMixtureGoldStar

Taq特異性強靈敏度高Ct值更低線性范圍更廣定量更準確反應(yīng)速度快比普通反應(yīng)可節(jié)省約40分鐘適合于普通和快速定量PCR程序熒光定量產(chǎn)品--染料法

某其它品牌

康為UltraSYBR-cDNA用內(nèi)參actin引物進行擴增，產(chǎn)物片段100bp。-模板濃度進行10倍稀釋，稀釋6個梯度。

康為世紀產(chǎn)品RNA--Trizol--超純RNA提取試劑盒--動物組織RNA--植物RNA--血液RNA--病毒RNA

逆轉(zhuǎn)錄--Sup