免疫組織 細胞培養(yǎng)課件2018

細胞培養(yǎng)和組織工程CellCultureandTissueEngineering張標(biāo)副教授廣東醫(yī)科大學(xué)組胚教研室JamesPAlisonTasukuHonjo2018諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎得主免疫療法抗腫瘤的機制PD1與PD-L1抑制劑抗腫瘤原理第四章細胞培養(yǎng)技術(shù)CellCultureTechniquePubMed上檢索細胞培養(yǎng)的論文數(shù)1905-2019“cellculture”第四章細胞培養(yǎng)技術(shù)一、培養(yǎng)細胞生長的基本條件與特性二、細胞培養(yǎng)的基本設(shè)備和準(zhǔn)備工作三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)四、細胞培養(yǎng)的主要觀察和檢測技術(shù)概述—細胞培養(yǎng)的應(yīng)用廣泛細胞培養(yǎng)技術(shù)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、分子生物學(xué)、組織工程學(xué)等領(lǐng)域已得到廣泛的應(yīng)用。概述—什么是細胞培養(yǎng)？

體外培養(yǎng)：是在無菌條件下，取出活體細胞、組織或器官，置于類似體內(nèi)生存的生理環(huán)境中，使其生長、增殖并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。體外培養(yǎng)細胞培養(yǎng)(cellculture)組織培養(yǎng)(tissueculture)器官培養(yǎng)(organculture)(Invitro)細胞培養(yǎng)(cellculture)：離散細胞（包括單個細胞）在體外培養(yǎng)。組織培養(yǎng)(tissueCulture)：組織塊的培養(yǎng)(細胞不離散)或體外培養(yǎng)的細胞群聚集并重建三維組織結(jié)構(gòu)的體外培養(yǎng)。器官培養(yǎng)(organCulture)：體內(nèi)器官原基、整體或局部，保持原有組織學(xué)結(jié)構(gòu)的體外培養(yǎng)。概述—各類體外培養(yǎng)的特點概述—細胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點實時性：能長時間、直接觀察、研究活細胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。2.可控性：

對象：均一性、重復(fù)性

類型：上皮？間質(zhì)？

性質(zhì)：正常？腫瘤？

條件：物理、化學(xué)、生物等因素可控

方法：采用各種研究技術(shù)、記錄方法可控優(yōu)點：概述—細胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點優(yōu)點：3.應(yīng)用廣：學(xué)科多，對象廣。4.較經(jīng)濟：可提供大量、重復(fù)性好、生物學(xué)性狀相似的實驗對象概述—細胞培養(yǎng)的優(yōu)點與缺點缺點：1.與體內(nèi)主要不同缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞間正常的相互作用。2.主要表現(xiàn)與體內(nèi)不同失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，細胞趨向單一化。實驗結(jié)果的解釋要謹慎！三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（一）基本操作和要求1.培養(yǎng)前準(zhǔn)備2.培養(yǎng)室和超凈工作臺的消毒3.洗手和著裝4.無菌培養(yǎng)操作5.安全操作(無菌操作)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)細菌污染酵母污染霉菌污染支原體污染三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（二）原代培養(yǎng)組織細胞在體外進行的首次培養(yǎng)。

1.組織塊培養(yǎng)法

2.消化培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)2.消化培養(yǎng)法

恒河猴骨髓間充質(zhì)干細胞原代培養(yǎng)rMSC的形態(tài)學(xué)觀察ABCD貼壁篩選法密度梯度離心法96h8d（三）傳代培養(yǎng)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)吸除培養(yǎng)液消化前細胞加消化液消化后細胞吸除消化液加培養(yǎng)液終止消化吹打制成細胞懸液計數(shù)接種（三）傳代培養(yǎng)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)（四）細胞的凍存和復(fù)蘇

保存細胞系或細胞株，是細胞培養(yǎng)中的重要工作。細胞可永久儲存在液氮中(-196℃)?；驹瓌t：慢凍快融，這樣可以最大限度地減少細胞在凍存和復(fù)蘇過程中的損害，保存細胞活力。細胞的凍存：保護劑：二甲基亞砜(DMSO)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)方法與過程：（1）選擇指數(shù)生長期的細胞。在凍存前一天換一次培養(yǎng)液。（2）配制含10%DMSO的凍存培養(yǎng)液。（3）消化細胞，用凍存培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，移入凍存管并作好標(biāo)記。（4）將凍存管放入4℃冰箱，約40min。（5）將凍存管置于-20℃冰箱，約30~60min。（6）將凍存管置于-80℃超低溫冰箱中過夜。（7）將凍存管置于-196℃液氮罐中長期保存。2.細胞的復(fù)蘇：快速融化。（1）將水浴鍋預(yù)熱至37℃。（2）從液氮罐中取出凍存管。迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中解凍（3）約1~2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解。取出凍存管，以1000rpm離心3min。（4）用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，放入超凈臺內(nèi)。（5）吸棄上清液，向離心管內(nèi)加入培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。細胞計數(shù)。接種密度以5×105/ml為宜。（6）將細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀況及時換液傳代。三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)三、細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)與細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)相關(guān)的網(wǎng)站/index.htm

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http://www.nibsc.ac.uk//

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http://www.stemcellnetwork.ca/

//實驗中的組織工程耳第五章組織工程

TissueEngineering一、組織工程的發(fā)展背景移植器官來源嚴重缺乏

1980’sJosephVacanti及RobertLanger結(jié)合醫(yī)學(xué)及工程材料背景，研發(fā)能修復(fù)人體病變組織與器官之治療方式

1990年舉辦第一屆組織工程學(xué)術(shù)研討會，1995年發(fā)行專業(yè)期刊

TissueEngineering

人造組織目前發(fā)展方向：皮膚、神經(jīng)、肌肉骨骼系統(tǒng)(骨,軟骨,肌肉)、心血管系統(tǒng)(血管,心瓣膜)、內(nèi)分泌器官(肝,胰,腎...)1.Theuseofacombinationofcells,engineeringmaterials,andsuitablebiochemicalfactorstoimproveorreplacebiologicalfunctions.2.Aninterdisciplinaryfieldofresearchthatappliesboththeprinciplesofengineeringandtheprocessesandphenomenaofthelifesciencestowardthedevelopmentofbiologicalsubstitutesthatrestore,maintain,orimprovetissuefunction(LangerandVacanti,1993).WhatisTissueEngineering?組織工程的基本概念

應(yīng)用生命科學(xué)和工程學(xué)的原則和方法，研究、開發(fā)用于修復(fù)、維護、促進人體各種組織或器官損傷后功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興科學(xué)。它是在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、大規(guī)模細胞擴增技術(shù)、新型醫(yī)學(xué)材料、體外組織構(gòu)建技術(shù)、移植免疫學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科迅速發(fā)展以后創(chuàng)建的邊緣學(xué)科。PubMed上檢索再生醫(yī)學(xué)、組織工程論文數(shù)“tissueengineering”1942-20191920-2019“regenerativemedicine”Regenerativemedicinereferstobothcelltherapyandtissueengineering.Celltherapyutilizesnewcellstoreplacedamagedcellswithinatissuetorestoreitsintegrityandfunction.Tissueengineeringencompassesthreeapproaches:theuseofbioactivemoleculessuchasgrowthfactorsthatencouragetissueinduction;theuseofcellsthatrespondtovarioussignals;andtheseedingofcellsintothree-dimensionalmatricestocreatetissue-likeconstructstoreplacethelostpartsoftissuesororgans(Howardetal.,2008).WhatisRegenerativeMedicine?二、組織工程基本方法A獲取組織B分離、培養(yǎng)種子細胞C制備三維支架D將種子細胞種植于支架E將細胞-支架復(fù)合物植入組織缺損處組織工程基本方法示意圖是將獲得的種子細胞進行分離純化、培養(yǎng)增殖，誘導(dǎo)分化，或經(jīng)適當(dāng)?shù)幕蛐揎椇?，接種在可降解的三維支架材料上于體外聯(lián)合培養(yǎng)，構(gòu)建成具有三維有序結(jié)構(gòu)、其各種特性與相應(yīng)組織相容的活的組織塊，然后植入體內(nèi)，替代病損組織器官的部分或全部功能。組織工程研究目標(biāo)是以最短的時間，使組織、器官的損傷得到最佳的修復(fù)，即完全再生性愈合。組織工程基本方法三、組織工程三要素組織工程三要素1.種子細胞2.具有生物活性（可降解）的三維支架材料3.各種細胞因子以促進細胞移行、增殖、分化

和有序排列。1．種子細胞理想種子細胞的要求來源廣，數(shù)量充足易培養(yǎng)，粘附力大，增殖強，可大量擴增遺傳背景穩(wěn)定，純度高。有特定生物學(xué)功能免疫排斥反應(yīng)極小或無反應(yīng)結(jié)構(gòu)和功能與再生組織的正常細胞相似臨床上易取得，供體損傷小，具有實用性組織工程研究的核心內(nèi)容來源異種：動物細胞同種異體：其他人細胞、胚胎干細胞自體：體細胞、成體干細胞、iPS1．種子細胞成體干細胞胚胎干細胞誘導(dǎo)多能干細胞（iPS）山中伸彌ShinyaYamanaka諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎（2012）“小保方晴子”事件

生物活性材料的設(shè)計是工程化地構(gòu)建與細胞外基質(zhì)相類似的支架材料，使其分子構(gòu)成能滿足種子細胞在理化性質(zhì)上的要求以及組織的生理學(xué)要求。2.組織工程支架材料理想的組織工程支架材料：①良好的生物組織相容性。②良好的生物降解性。③具有理想三維立體孔隙和滲透性。④具有可塑性和一定的機械強度。⑤具有良好的材料—細胞界面。2.組織工程支架材料聚合物材料：聚乳酸、聚乙醇酸及二者共聚物陶瓷材料：羥基磷灰石、磷酸鈣水泥、生物玻璃天然材料：膠原、透明質(zhì)酸、甲殼素、珊瑚復(fù)合材料：磷酸鈣+聚乳酸；納米材料脫細胞材料：骨、肌腱、真皮、膀胱、軟骨智能材料：聚異丙基丙烯酰胺支架材料scaffordmaterial支架材料scaffordmaterial

研究不同生長因子對不同來源的種子細胞移行、增殖、分化和有序排列及其與生物活性材料相容生長是一個復(fù)雜而極具挑戰(zhàn)的工作。BMP促進成骨VEGF、PDGF促進血管化IGF、bFGF促進分化NGF促進神經(jīng)再生3.生長調(diào)節(jié)因子

RA胚胎干細胞－－－－－－－－－－神經(jīng)細胞

DMSO胚胎干細胞－－－－－－－－－－肌肉細胞

TGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干細胞－－－－－－－－－－血管和內(nèi)皮細胞

RA+胰島素+T3胚胎干細胞－－－－－－－－－－脂肪細胞

BMP-2,BMP-4胚胎干細胞－－－－－－－－－－軟骨細胞

地塞米松，磷酸甘油胚胎干細胞－－－－－－－－－－骨細胞

bFGF,煙酰胺胚胎干細胞－－－－－－－－－－胰島樣細胞胚胎干細胞的體外定向誘導(dǎo)分化因子以材料工程的眼光，除了以上三種基本要素外，以下三個課題是研究開始進行時所必須考量的：如何更精確的控制組織生長支架的降解與支撐強度間之關(guān)系?如何引導(dǎo)細胞向支架內(nèi)部及頂端生長?如何增加細胞的生長效率?4.組織工程其他要素解決方案：以非均質(zhì)性支架，控制不同時期的降解速率。以超音波或電磁場等物理源，配合支架中添加細胞粘附蛋白，促進細胞增生及導(dǎo)引細胞生長方向。以循環(huán)生物反應(yīng)器(bioreactor)做為組織工程培養(yǎng)系統(tǒng)。4.組織工程其他要素釋放載體智能化—生長因子釋放載體將VEGF載在PLGA多孔支架內(nèi)，而PDGF預(yù)先用PLGA包裹，再與支架復(fù)合形成雙重生長因子釋放體系。此類支架在開始的7天以1.7pmol/d的劑量在體外釋放VEGF，而后以0.1-4.2pmol/d的劑量釋放PDGF，可由PLGA的組成和分子量進行調(diào)控。VEGF是血管新生的起始因子。PDGP能促進血管成熟。3D生物打印機光固化成型激光打印噴墨打印microextrusion打印機有兩個噴頭，一個噴涂細胞（黃色），另一個噴涂水溶膠（紅色）以支持和固定細胞，待細胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)固后可以將水溶膠移除打印機的噴頭及其作用器官打印的過程三維生物打印機的原型機，技術(shù)人員正在試驗打印程序一、計算機輔助設(shè)計出該器官的結(jié)構(gòu)藍圖二、將所需細胞精確“打印”到位三、后期處理促進細胞融合和器官成熟技術(shù)步驟3DPrintingofOrgans-On-Chips肢體臟器量販店給我來顆心！路線一：功能細胞+支架材料→體外培養(yǎng)→成熟生物組織→植入體內(nèi)路線二：功能細胞+支架材料→體外短期培養(yǎng)→植入體內(nèi)，逐漸發(fā)育成形四、組織工程路線圖舉例：組織工程與心肌梗死1.種子細胞與心肌梗死1.種子細胞與心肌梗死1.種子細胞與心肌梗死1.種子細胞與心