利用酶動力學(xué)擬合在密閉條件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

利用酶動力學(xué)擬合在密閉條件下香菇呼吸速率方程及米氏方程摘要：本研究對香菇在273K、283K和293K條件下密閉容器中的氧氣和二氧化碳隨時間濃度變化進(jìn)行了測定，通過酶動力學(xué)原理和利用非線性估計法、多重回歸分析分別獲得氣體成分的變化率曲線和米式方程，從而獲得相應(yīng)參數(shù)，求得反映呼吸狀態(tài)的呼吸熵動態(tài)變化規(guī)律以及溫度影響參數(shù)—活化能，這樣就可以求出在任意溫度、有氧呼吸氣體環(huán)境條件下果蔬的最大呼吸速率，為氣調(diào)包裝系統(tǒng)設(shè)計提供必要依據(jù)。關(guān)鍵字：酶動力學(xué)原理非線性估計法多重回歸法米氏方程呼吸熵活化能香菇Lentinasedodes(Berk)sing，又叫香菌、冬菇，屬白蘑（口蘑）科香菇屬，為食用菌類蔬菜，在蔬菜中屬于呼吸強(qiáng)度較大的一類品種。植物活體的呼吸總方程式為：植物體貯藏環(huán)境中氧氣以及二氧化碳含量直接影響到植物體的新陳代謝，呼吸速度越快消耗體內(nèi)的糖分等物質(zhì)就越多,鮮度下降就越快。植物的有氧呼吸涵蓋了一系列的酶催化反應(yīng)，其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通過三羧酸（TCA）循環(huán)獲得產(chǎn)物CO2[1]。因此，有效的氣調(diào)包裝能抑制香菇的呼吸速率及新陳代謝作用，延緩衰老達(dá)到保鮮的效果。呼吸強(qiáng)度是設(shè)計氣調(diào)包裝方案的重要指標(biāo)參數(shù)，影響呼吸強(qiáng)度的因素有許多，如溫度、濕度、二氧化碳濃度、氧氣濃度和時間等。這些參數(shù)將為包裝膜透氣率的計算和選擇提供理論基礎(chǔ)。本研究延承了Leeetal.（1991）[2]的三維參數(shù)模型—時間（t）、氧氣濃度（O2%）和二氧化碳濃度（CO2%）濃度之間的相互關(guān)系，建立酶動力學(xué)方程即Michaelis-Menten方程，同時考慮三種參數(shù)影響，得到香菇呼吸模型，為氣調(diào)包裝參數(shù)的選擇提供理論基礎(chǔ)[3]。1材料與方法1.1材料香菇采購于上海楊浦區(qū)渭南路農(nóng)貿(mào)市場，選取菇型圓整、菇柄正中、不開傘，卷邊整齊，無病斑的香菇為實驗材料，并進(jìn)行清洗、瀝干處理，實驗前將香菇在預(yù)設(shè)的三種溫度（293K、283K和273K）下貯藏5個小時直至達(dá)到實驗所需溫度。1.2儀器103層析儀[色譜柱為：Porapak-Q柱（60~80目）+13X（60~80目）：上海儀器廠1.3主要實驗方法1.3.1密閉實驗設(shè)置實驗通過初始條件即O2：21%；CO2：0.0%，將一定質(zhì)量的香菇放于一定體積的玻璃容器中，瓶底裝入干燥劑（一定量的硅膠和CaCl2（s））以控制體系濕度，因為濕度會影響到貯藏樣品的水分活度，水分活度的大小直接影響到生物體代謝快慢，這就會對體系氧氣和二氧化碳的濃度變化有較大影響[4]。其次，將瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后（橡皮塞上有一φ8mm的小孔，用φ15mm×5的硅膠墊密封），置于一定的水浴或冰浴中待溫度恒定，然后每隔0.5-1.0小時用注射器量取0.5mL氣體成分注入層析儀進(jìn)行檢測,平行檢測兩次，同時記錄下O2、CO2對應(yīng)檢測的峰高，計算出對應(yīng)體系中的百分含量。層析儀中參數(shù)設(shè)置為載氣：99.995%N2；流速15mL/min；柱溫：40℃；檢測器：TCD，溫度：80℃；進(jìn)樣溫度：40℃；定量方法：外標(biāo)法。每組實驗的設(shè)置見表1：表1香菇呼吸密閉體系環(huán)境設(shè)置Table1Thedesignofclosedsystemmethodofthreedifferenttemperatures社溫度擴(kuò)（奶K徹）械273責(zé)283勞293眨香菇質(zhì)量室（楚g筆）完180.9胳295粒281.6白容器體積涉（緒L頌）編1濱2余2畏空隙體碧（鹿L薦）音1.22峰0.89干0.75托處理條件壁冰浴丸恒溫水浴償恒溫水浴1.3.2密閉容器中的呼吸速率方程的擬定由于各類蔬菜的品種和個體差異較大，呼吸環(huán)境中氧氣、二氧化碳濃度隨時間的變化也千差萬別，所以歷來文獻(xiàn)都沒有參照統(tǒng)一的方程來描述氣體濃度隨時間的變化。依據(jù)米氏方程的Lineveaver-burk曲線圖可知呼吸化學(xué)方程在初始階段反應(yīng)速度維持恒定即呈線性，但隨著時間的增長，曲線的斜率變化速度減少，反應(yīng)速度趨向一恒定值，因此，簡單的直線方程并不能真正地表達(dá)濃度與時間的關(guān)系，氣體濃度隨時間變化的曲線呈弧線形，并無限趨近一定值，將所有的參變量（rO2，rCO2）和應(yīng)變量（[O2]，[CO2]）同時表示成時間（t）的函數(shù)，通過上述推論以及結(jié)合STATISTICS軟件中的非線形估計法[5]（NonlinearEstimation），選取損失函數(shù)（L）值最?。〒p失函數(shù)（L）=（觀察值（OBS）-預(yù)測值（PRED））2），復(fù)相關(guān)系數(shù)(MultipleR)接近于1的公式作為反映不同溫度下香菇在密閉容器中氣體濃度與時間的關(guān)系式：[1][2]其中，氧氣和二氧化碳的濃度（[O2]，[CO2]）以百分?jǐn)?shù)%表示，時間t以小時（hr）計算。因此，根據(jù)式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt：[3][4]幣則呼吸速率為鉛：[5][6]褲式中謠，醫(yī)r替—傭呼吸速率（氧女氣的消耗率或鋒二氧化碳的產(chǎn)歪生率）浩（漠mg/k村g脊﹒楊h春r漫）；沉M辟O2/CO2稅—靜氧氣或二氧化匪碳的摩爾質(zhì)量映（鞭g/mo態(tài)l嬌）；灶V囑—伐空隙體積房，棉L鐘；設(shè)W呈—觀密閉體系中香愁菇的重量鹽，鴿g蘭；折P罰—文體系壓強(qiáng)畫（銜P別a調(diào)）；仆R活—校理想氣體常數(shù)拜（唇8.314J斧/mo床l筍﹒存K嘴）；某T帆—趟開氏溫度剃（共K頁）。芳棋Micha病elis-M住ente賽n幫方程的確張立僵屋依據(jù)酶動力學(xué)絮呼吸模型旱[4]鑄要求體系保持瘡有氧呼吸狀態(tài)困即銅[O卡2懼]>1.5爛%講或跡[CO噴2物]<20葡%夾才是有效的兆[6]尚，氧氣過低或現(xiàn)二氧化碳過高著將導(dǎo)致香菇無幸氧呼吸，則不搞符合米氏規(guī)律芹。在本次實驗窯中同時測定了蓋單位時間內(nèi)底繡物（氧氣）的岸消耗量以及產(chǎn)晌物（二氧化碳站）的生成量。尚其中二氧化碳尋又是化學(xué)反應(yīng)津的非競爭性抑榴制劑，因此，閣依據(jù)米氏方程待的非競爭性作種用的速度方程嘩為如下公式：[7][8]籠式中礦，應(yīng)V遇m臟、裕K喝m療和答K棒i隔—筑調(diào)整因子；敗V努mi所—貿(mào)最大反應(yīng)速率歉（氧氣消耗的優(yōu)最大速率或二皮氧化碳產(chǎn)生的愈最大速率）班（唉mg/k讀g轟﹒廢h猜r夸）；劃K躁mi泉—嫁表觀米氏常數(shù)怕（錯%朋）；齡K系i削—符抑制系數(shù)泳（弱%繳）。繩通過實驗所測取結(jié)果利木用頭STATIS始TIC吵A成軟件進(jìn)行多重悲線性回歸分析咬求得其值。再而痰r吵CO2/透r潑O2玻的值就是呼吸倆熵刃（懷R百Q(mào)蕉）漫[7]腳，它是表現(xiàn)氧液氣與二氧化碳耀共同作用下香償菇呼吸狀態(tài)的褲動態(tài)因子，也版是定性代謝途受徑以及表征脫驚羧酶或氧合酶藥系統(tǒng)的一個有幫效參數(shù)。本次餐實驗中要求體紹系維持在有氧鄰呼吸狀態(tài)，所摧以通過計算浴，邊R痰Q厲應(yīng)該小于或接悅近系于丘1福，李即憐r壓CO2漠≤美r盤O2倒。稅離阻溫度對香菇呼部吸作用的影昨響渡綁氧氣和二氧化作碳的變化率除匆了受濃度、酶脂等因素的影響啊，最關(guān)鍵的是革受到溫度的影席響，在求得了課不同溫度下氧喊氣和二氧化碳膛的最大變化率宜（薪V透m怕）后，通地過曠Arrhen稻ius融[8]妙關(guān)系葉將州1/潤T俗與折LnV倘m暗進(jìn)行線性回歸棵，其斜率值送為坡Ea/則R劉，卸E衫a怕（計kJ/mo剛l或）就是活化能零，由此可推算宗其他溫度下香竄菇呼吸作用的保最大呼吸速率冶，其預(yù)測方程至為：[9]蛛式中部，廳V用m0璃—拴已知的氧氣最濟(jì)大消耗率或二襯氧化碳的最大句產(chǎn)出率骨（你mg/k奶g淚﹒蘇h粉r船）；茅T腥0宵—昆已知的溫度址（左K按）；艷V貪m堤—單T經(jīng)溫度下的氧氣抽最大消耗率或誰二氧化碳的最請大產(chǎn)出率賊（肯mg/k句g來﹒寺h翼r龜）。2結(jié)果與分析暮2.1搶鹽不同溫度下香紛菇在密閉體系常中氣體濃度函陳數(shù)的確定起各個溫度下的犬氧氣和二氧化貝碳隨時間的變榨化的回歸方程李見工表您2延。愚由等表淡2昏可以看出由實天驗數(shù)據(jù)擬合出鐮的曲線有較好誠的吻合性，從黎而得出各個溫紋度下以時間為溫自變量，氧氣豈與二氧化碳濃灶度為應(yīng)變量的仙方程式。斥表挨2責(zé)產(chǎn)氧氣、二氧化上碳濃度隨時間幼變化的非線性腸回歸方程民Table詢2Nonl弱inear仗estima反tionr狠egress博ionof辭O定2照,CO艙2宴change翅with惹time矛溫徐度濃K戴非線性回歸估好計方程蒙損失函數(shù)描（流Los郵s膊）介復(fù)相關(guān)系數(shù)涂（免Multip院le遙R宵）凱293新9.77摩0.993裝3.56君0.988陳283肢9.60傅0.987欣6.37貢0.993艇273旬10.89嶄0.987芳5.21香0.963吊2.2Mi承chaeli棟s-Ment載e間n貝方程及各參數(shù)壺的確立相在求得了各個竟溫度下氧氣和覆二氧化碳濃度衫與時間的擬合憶方程后，就可欣以根據(jù)公姥式奸[5]~[8朝]求，求得氧氣的練呼吸消耗速遠(yuǎn)率衛(wèi)r暗O2團(tuán)和二氧化碳的緩呼吸生成速解率傷r勸CO2連，擬合曲線見蓮圖幅1吐；根據(jù)公俯式仇[7特]棗、再[8乳]仇通過多重線性河回歸分析，獲然得嗽表描3紡結(jié)果：景表臺3情態(tài)香菇注在脂273艦K嬌、艘283挨K米和住293朵K享下根據(jù)多重回銀歸求得米氏方請程各參數(shù)值掛Table于3Estim挽atedv泰alues泡forMi坊cheali遇s-Ment籍enmod宏elof駐shiita梳kein軌273K,2底83Kan葬d293K邁deter象minedb欣ymult返iplel近inear圾regres港sion炸溫度

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