固定化酶和細(xì)胞課件

Chapter5

ImmobilizedEnzymeandCell固定化酶和細(xì)胞酶應(yīng)用過程中的主要瓶頸酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pH條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。固定化技術(shù)Contentsofchapter51、什么是固定化技術(shù)和固定化酶2、固定化酶的研究歷史3、酶的固定化技術(shù)4、固定化酶的特點(diǎn)GoGoGoGo6、細(xì)胞、原生質(zhì)體的固定化，自學(xué)5、固定化酶的應(yīng)用Go化學(xué)偶聯(lián)酶固定化間歇可溶交聯(lián)包埋吸附間歇連續(xù)酶的固定化技術(shù)和固定化酶固定化酶的三種形式固定化酶：經(jīng)提取和分離純化后的酶固定化菌體(死細(xì)胞)：含酶菌體或菌體碎片固定化細(xì)胞：在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；可連續(xù)化生產(chǎn)；穩(wěn)定性好。缺點(diǎn)：

1.固定化過程中往往會引起酶的失活

2.固定化酶在化學(xué)催化反應(yīng)中存在空間位阻固定化酶的研究從50年代開始，1953年德國的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體與羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等結(jié)合，制成固定化酶。60年代后期，固定化技術(shù)迅速發(fā)展起來。1969年，日本的千煙一郎首次在工業(yè)上生產(chǎn)應(yīng)用固定化氨基?；笍腄L-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，實(shí)現(xiàn)了酶應(yīng)用史上的一大變革。在1971年召開的第一次國際酶工程學(xué)術(shù)會議上，確定固定化酶的統(tǒng)一英文名稱為Immobilizedenzyme。2固定化酶的研究歷史3酶固定化技術(shù)活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固定化結(jié)合酶的高級結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。固定化酶操作的注意事項(xiàng)酶和細(xì)胞固定化的模式吸附法

利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。操作簡便，條件溫和，不會引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，而且可反復(fù)使用。由于靠物理吸附作用，結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。首先被采用包埋法的酶有：固定化胰蛋白酶固定化木瓜蛋白酶固定化－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙烯酰胺，丙烯酰胺，引發(fā)劑海藻酸鈣包埋法裝置將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2

溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。顆粒大小可實(shí)時(shí)監(jiān)控脂質(zhì)體包裹酶交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法。戊二醛有兩個(gè)醛基，這兩個(gè)醛基都可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng)，形成席夫（Schiff）堿，而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。交聯(lián)法制備的固定化酶或固定化菌體結(jié)合牢固，可以長時(shí)間使用。但由于交聯(lián)反應(yīng)條件較激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，致使酶活力損失較大，而且制備成的固定化酶或固定化菌體的顆粒較小，給使用帶來不便。為此，可將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用，以取長補(bǔ)短。常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應(yīng)用最廣泛的是戊二醛。酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶本章目錄酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)脂肪酶在畢氏酵母表面展示與篩選C.

antarctica脂肪酶B及M.

miehei脂肪酶基因在酵母細(xì)胞表面的展示4固定化酶的特性：將酶或含酶菌體固定化制成固定化酶或固定化菌體以后，由于受到載體等的影響，酶的特性可能會有些變化。

固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。酶經(jīng)過固定化后，其作用的最適pH值往往會發(fā)生一些變化。這一點(diǎn)在使用固定化酶時(shí)，必須引起注意。影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個(gè)，一個(gè)是載體的帶電性質(zhì)，另一個(gè)是酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)。固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。本章目錄乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—AlaAminoacylase

氨基?；?固定化酶的應(yīng)用世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶。1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基?；?，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，將L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸經(jīng)過消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再進(jìn)行拆分。生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。高果糖漿的生產(chǎn)世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細(xì)胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，催化葡萄糖異構(gòu)化生成果糖，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。2023/4/10生產(chǎn)果葡糖漿的固定化酶反應(yīng)器K.Buchholz,etal.(Germany),2005;2008Thisisthelargestprocessperformedwithabout1500tofimmobilizedenzymesproducingaglucose–fructosesyrup(HFCS,highfructosecornsyrup)withmorethan10milliontofproduct(drymatter)peryear

Typicalfixedbedreactor

12–20t(drysubstance,d.s.)perkgofbiocatalystwithahalf-lifeof80–150days.Reactordimensionstypicallyare1.5mdiameterand5mheightoffixedbedbioreactors,withoperationat58–60°C生物催化不對稱氧化還原CO2合成甲醇（Ei-Zahab,etal.2008；MatsudaT.etal.2009）四種酶，包括甲酸、甲醛、乙醇和谷氨酸脫氫酶共固定化在一種顆粒上輔酶NADH固定在另顆粒上向兩種固定化顆粒的懸浮液中通CO2氣體進(jìn)行反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了輔酶的內(nèi)部循環(huán)該固定化系統(tǒng)表現(xiàn)出較好的循環(huán)使用的穩(wěn)定性酶和輔酶共固定化E1E2環(huán)氧琥珀酸水解酶生產(chǎn)L-(+)-酒石酸江蘇常茂生化常茂生化利用凝膠包埋固定化含環(huán)氧琥珀酸水解酶的整細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-(+)-酒石酸，年生產(chǎn)規(guī)模6000噸，占世界市場15%，改變了傳統(tǒng)從葡萄酒石提取的單一技術(shù)局面。獲得高酶活固定化細(xì)胞，單元反應(yīng)柱生產(chǎn)能力增加50%，酶反應(yīng)半衰期8個(gè)月以上，并且是世界上最大型的凝膠包埋固定化微生物細(xì)胞生產(chǎn)裝置大型固定化細(xì)胞裝置底物產(chǎn)物31交聯(lián)鏈孢霉菌細(xì)胞拆分DL-泛解酸內(nèi)酯交聯(lián)提高酶在有機(jī)底物體系中的穩(wěn)定性浙江鑫富

利用戊二醛交聯(lián)固定化的鏈孢霉菌細(xì)胞(含內(nèi)酯水解酶)催化拆分DL-泛解酸內(nèi)酯，已實(shí)現(xiàn)D-泛酸鈣和D-泛醇的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化年產(chǎn)量5000噸，占世界市場44%5000L生物反應(yīng)器交聯(lián)固定化菌體在反應(yīng)OOOH+消旋化DL-PLOOOHL-PLOHOHCOOHD-PAOOOHD-PL內(nèi)酯化D-泛解酸內(nèi)酯水解酶浙江鑫富藥業(yè)酶-化學(xué)耦聯(lián)不對稱合成左旋帕羅醇

原料利用率提高：底物近100%轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物，原子經(jīng)濟(jì)性大幅提高。節(jié)能減排效果明顯：有機(jī)溶劑用量減少約59.3%、“三廢”排放減少約39.4%。產(chǎn)品質(zhì)量提高：ee值大于99.5%（化學(xué)法99.0%）?？挂钟羲幣亮_西汀手性中間體左旋帕羅醇的合成浙江九洲藥業(yè)工程菌，酯酶；大孔樹脂固定化酶；重復(fù)使用20次以上（IndustrialEngineeringChemistry&Research(2010,2008a,2008b)酵母展示脂肪酶在生物合成中的應(yīng)用脂肪酶CALB/RML?；w油，脂肪酸、己酸等

酰基受體甲醇，乙醇，糖醇等反應(yīng)體系非水相/離子液等產(chǎn)物及性質(zhì)芳香酯，表面活性劑，生物柴油等應(yīng)用酵母展示脂肪酶在短鏈芳香酯合成的應(yīng)用無水體系中不同酸醇摩爾比對合成己酸乙酯的影響無溶劑體系下酶催化合成芳香酯酯酸醇摩爾比6h轉(zhuǎn)化率12h轉(zhuǎn)化率24h轉(zhuǎn)化率乙酸丁酯乙酸異戊酯

乙酸葉醇酯乙酸香葉酯丁酸乙酯丁酸異戊酯丁酸葉醇酯丁酸香葉酯己酸乙酯己酸丁酯己酸己酯己酸香葉酯庚酸乙酯辛酸乙酯1：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：21：225.3%22.0%25.0%9.5%72.9%70.1%80.8%19.0%88.0%56.3%42.4%18.8%69.1%24.1%40.5%40.1%53.6%38.1%88.5%90.4%84.6%76.9%90.2%88.9%72.2%60.2%87.7%55.0%79.0%85.9%85.7%85.7%89.4%92.3%84.6%90.5%90.0%90.6%84.0%90.6%88.0%87.9%無水體系下合成芳香酯酶傳感器酶傳感器是由固定化酶與傳感元件兩部分組成的，其中酶是與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成的不溶于水的固定化酶膜。最常用的酶傳感器是酶電極，即將固定化酶膜與轉(zhuǎn)換電極做在一起，當(dāng)酶膜與被測物發(fā)生催化反應(yīng)而生成電極活性物質(zhì)后，電極測定活性物質(zhì)并將其轉(zhuǎn)換為電信號輸出。酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。酶電極一般可根據(jù)電極檢測物理量的不同分為電流型和電壓型，前者一般有氧電極、H2O2電極等，后者有NH3、CO2、H2電極等。較典型的一種酶電極為葡萄糖酶電極。葡萄糖＋醌＋H2O 葡萄糖酸＋氫醌葡萄糖氧化酶氫醌 醌＋2H＋＋2e－Pt鉑電極葡萄糖酶電極葡萄糖酶電極的敏感膜是葡萄糖氧化酶（GOD），它被固定在聚乙烯酰胺凝膠上。在酶膜的作用下葡萄糖發(fā)生氧化反應(yīng)，消耗掉氧而生成葡萄糖酸和過氧化氫。通過用電極測量被消耗的氧或生成的過氧化氫就可了解葡萄糖濃度。

手掌型葡萄糖(glucose)分析儀脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應(yīng)。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青霉素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3一些常見的酶電極底物酶電極5′－腺苷酸5′－腺苷酸脫氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脫氫酶Pt過氧化物過氧化氫酶Pt(O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt(O2)D-氨基酸D－氨基酸